推荐以下操作以提高回收效率：适当增加磁珠与待纯化样本或纯化洗脱液在混匀后的孵育&磁吸时间；适当提高磁珠纯化倍数（如纯化样本步骤，非片筛）；使用新鲜配制的 80% 乙醇；严格控制磁珠晾干的时间，避免过度晾干。

适用于片段化后 DNA 分布范围较宽且期望得到稳定的数据产出的情况。但获得狭窄峰型也会降低文库丰度，故操作少量样本时应注意损耗。双筛分为片段化后双筛、连接后双筛两种。在双筛的过程中短片段损失更多但分布更集中，而长片段与之相反。由于连接后双筛时已引入了接头，因此相对片段化后双筛损失更少，但峰型相对较宽。此时还应注意：
①任意形式的双筛都会带来 DNA 的损耗，因此扩增循环数需要至少增加 1 个循环；
②任意形式的双筛都会带来原始文库丰度的损耗，可能会导致测序数据中的重复率的增加；
③打断片段的平均大小应接近预期片段大小，以减少样本损失。

可能原因为接头未稀释，推荐解决方案：对于低起始量的样本建库，应严格定量并按照说明书推荐进行接头稀释。

可能原因								解决方案
样本严重降解								降解较为严重的样本，如 FFPE C 级样本，同等片段化时间下，DNA 分布可能为 150-200 bp。建议对样本进行分级后按照分级条件设置酶切时间
片段化时间过长								应避免同时手工操作过多样本，操作时间跨度过长会因片段化反应时间被动延长; 反应体系配置尽量低温操作
室温操作时间过长								确保片段化体系各组分在转移至 PCR 仪之前，始终置于冰上； 提前运行 PCR 仪，模块温度稳定后暂停，体系配置完成后立即开始孵育程序

推荐按照如下方式对 FFPE 样本进行分级和实验操作：

分级

分级标准

推荐起始量

酶切时间  (250 bp)

推荐扩增循环数  (250 bp)

FFPE B+

~15 kb  有主带，存在轻微弥散，主带比弥散状带明显

≥  100 ng

与常规  gDNA  一致

与常规  gDNA  一致

FFPE B

~15 kb  有隐约可见主带，同时存在中度弥散

≥  100 ng

比常规  gDNA  缩短约  5 min

比常规  gDNA  多  1-2  个

FFPE C

在  200-2500 bp  之间存在弥散状分布，无清晰主带

≥  100 ng

比常规  gDNA  缩短约  10 min

比常规  gDNA  多  2-3  个

FFPE D

主要分布在  250-1000 bp，呈弥散状

≥  100 ng

比常规  gDNA  缩短约  15 min

比常规  gDNA  多  3-4  个

实验条件：使用 NadPrep® 快速 DNA 酶切文库构建模块 v2 搭配 NadPrep® Universal Stubby Adapter (UDI) Module 对不同分级的 FFPE 样本建库后的文库片段分布如下图所示(Agilent 2100, DNA 1000 Kit)：

可能原因								解决方案
DNA 溶液中EDTA 浓度＞1mM								推荐使用磁珠法或柱式法纯化核酸，并用 Nuclease Free Water 溶解
DNA 纯度较差								样本纯度要求  OD260/ OD280=1.8-2.0; OD260/OD230=2.0-2.5。若样本中存在胍盐及杂蛋白污染时会影响酶切效率，推荐使用磁珠法或柱式法纯化核酸，并用 Nuclease Free Water 溶解
反应体系混匀不充分								确保片段化 Mix 充分混匀后，再加入样本中，并再次充分混匀后进行反应
连接步骤操作不合理导致片段自连								严格按照说明书推荐流程操作

可能原因	解决方案
起始投入量不准确	实际其实投入量偏低，建议使用 Qubit 进行精 确定量
磁珠纯化过程中丢弃部分磁珠	采用涡旋混匀时，确保管盖紧闭，弃上清过程 切勿丢弃磁珠

可能原因	解决方案
转化后文库被未转化文库污染	使用带滤芯 Tips； 转化结束后及时更换新的乳胶手套，更换新的 工作台面以及新的移液器
Bisulfite Reagent 易发生氧化、结晶析出，导 致亚硫酸盐溶液浓度降低，影响转化效率	在有效期以内使用 Bisulfite Reagent； 控制 Bisulfite Reagent 暴露在空气中的时

试剂盒在没有被紫外灯照射的情况下，在台面室温过夜，可以继续使用。NadPrep® 快速DNA酶切文库构建试剂盒性能稳定，放置在室温下12 h内，建库表现无损。

NadPrep® 快速DNA酶切文库构建试剂盒推荐冻融15次以内。为保证数据质量，建议分装使用，分装前请充分混匀。