NanOnCT Panel v1.0 靶向实体瘤研究中被着重关注的 69 个基因,覆盖基因组约 375 kb 区域。支持包括碱基替换,插入 / 缺失,基因重排,基因扩增,微卫星稳定性在内的多种变异信 息的富集。其探针设计经过优化,提升了对细胞外游离 DNA(Cell-free DNA, cfDNA)文库的捕获效果。
编码区覆盖
AKT1 |
ALK |
APC |
AR |
ARAF |
ATM |
BRAF |
BRCA1 |
BRCA2 |
CCND1 |
CDH1 |
CDK12 |
CDK4 |
CDK6 |
CDKN2A |
CTNNB1 |
DDR2 |
EGFR |
ERBB2 |
ERCC2 |
ESR1 |
EZH2 |
FGFR1 |
FGFR2 |
FGFR3 |
GNA11 |
GNAQ |
GNAS |
HRAS |
IDH1 |
IDH2 |
JAK2 |
JAK3 |
KDM6A |
KIT |
KRAS |
MAP2K1 |
MAP2K2 |
MDM2 |
MET |
MLH1 |
MPL |
MSH2 |
MSH6 |
MTOR |
MYC |
NF1 |
NPM1 |
NRAS |
NTRK1 |
NTRK2 |
NTRK3 |
PDGFRA |
PIK3CA |
PMS2 |
PTCH1 |
PTEN |
PTPN11 |
RAF1 |
RB1 |
RET |
ROS1 |
SMARCB1 |
SMO |
STK11 |
TERT |
TP53 |
TSC1 |
TSC2 |
|
非编码区覆盖
ALK |
BRAF |
EGFR |
FGFR2 |
FGFR3 |
MET |
NTRK1 |
NTRK2 |
PDGFRA |
RET |
ROS1 |
微卫星位点
BAT-25 |
BAT-26 |
BAT-40 |
BAT-RII |
NR-21 |
NR-22 |
NR-24 |
NR-27 |
MONO-27 |
D2S123 |
D5S346 |
D17S261 |
D17S520 |
D18S34 |
表1. NanOnCT Panel v1.0 对 gDNA 和 cfDNA 文库的捕获表现
gDNA 捕获效率(%) |
cfDNA 捕获效率(%) |
|
HiSeq X Ten, PE150 |
87.02 |
87.35 |
MGISEQ-2000, PE100 |
85.47 |
87.00 |
优化的探针设计
图1. 优化探针设计的 NanOnCT Panel v1.0 对 cfDNA 文库的目标区域捕获覆盖更加均一。
多种变异分析
图2. NanOnCT Panel v1.0 捕获数据中变异频率与标准品标称频率的一致性。注:标准品为肿瘤 SNV1-25% gDNA 标准品(菁良,GW-OGTM004)。
特定微卫星覆盖
图4. NanOnCT Panel v1.0 在 HiSeq X Ten 平台对 14 个微卫星有效覆盖。可跨过微卫星序列全长的读长被计为有效读长(Effective reads)。
表2. NanOnCT Panel v1.0 对血液 gDNA / FFPE / 血浆cfDNA / 尿液 cfDNA 等样本类型文库的捕获表现
血液 gDNA |
血浆 cfDNA |
严重降解 FFPE |
尿液 cfDNA |
|
以 reads 计算的中靶率(%) |
87.0 |
83.7 |
85.2 |
82.6 |
覆盖深度 ≥ 0.2 x 平均值的靶区比例(%) |
100.0 |
100.0 |
100.0 |
99.9 |
覆盖深度 ≥ 0.5 x 平均值的靶区比例(%) |
99.9 |
98.6 |
84.9 |
93.2 |
本产品仅限研究使用,不用于临床诊断。
货号 |
管盖
颜色 |
产品名称 |
包装
体积 |
包装/储存温度 |
1001902 |
|
NanOnCT Panel v1.0, 16 rxn |
70 μL |
–20℃ |
1001901 |
|
NanOnCT Panel v1.0, 96 rxn |
415 μL |
–20℃ |
可能原因 | 解决方案 |
样本存在反应抑制剂 (如 EDTA、高 pH 值等) | 对样本进行纯化后再进行试验 |
试剂保存不当 | 试剂总量较大时,建议分装使用,避免反复冻融 |
推荐如下:
• 对于 Size 分布均一、所需测序数据量相同的文库,一般在文库混杂投入比>50 % 的前提下,推荐 500 ng/文库的投入量,以期提高文库丰富度,降低测序数据的重复率;
• 对于 Size 分布不均一、样本质量差异较大、所需测序数据量不同的文库,一般在文库混杂比>50 % 的前提下,推荐按照摩尔量进行相应比例的混合。
注:1. 混杂投入比=样本进入杂交反应的文库量/样本实际文库构建产出总量*100 %;
2. moles of dsDNA (mol) = mass of dsDNA (g) / ((length of dsDNA (bp) x 617.96 g/mol) + 36.04 g/mol)
目前混合文库的浓缩推荐采用真空浓缩法或磁珠浓缩法,具体操作可参考DNA文库杂交捕获操作指南。相关测试结果表明不同浓缩法的结果基本一致,仅存在轻微GC差异偏好。但真空法更经济、操作简单,而磁珠法则可适配自动化工作站,可根据具体情况进行选择:
浓缩方式 |
优点 |
缺点 |
真空浓缩 |
操作简便、时间可控、损失低 |
需要真空浓缩仪 |
磁珠浓缩 |
无需另购仪器、可适配自动化工作站 |
存在DNA损失且需求试剂量增加、存在GC偏好性 |
捕获终文库得量与许多因素存在相关性,除去实验操作影响外,一般会有以下理论影响因素:样本类型、起始混杂文库总量、Panel 大小、杂交时长、扩增循环数等。为获得良好的实验数据,在满足上机测序所需用量的前提下,应尽量控制捕获后扩增循环数。Illumina®平台在上机测序前会对文库进行指数式扩增的成簇反应,故所需的上机文库总量较低(具体需要根据各测序仪型号以及测序公司要求决定)。对于不同 Panel,可在实验初期参考以下推荐列表,后期再根据具体结果进行调整:
Panel大小 |
1-plex (500 ng) |
4-plex (2,000 ng) |
8-plex (4,000 ng) |
12-plex (6,000 ng) |
---|---|---|---|---|
>10 Mb |
10 cycles |
8 cycles |
7 cycles |
6 cycles |
1 Mb-10 Mb |
12 cycles |
10 cycles |
9 cycles |
8 cycles |
50 Kb- 1Mb |
13 cycles |
11 cycles |
10 cycles |
10 cycles |
1 Kb-50 Kb |
14 cycles |
12 cycles |
11 cycles |
11 cycles |
针对纳昂达商品化 Panel,可参考下表进行选择:
Panel名称 |
大小 |
混杂 |
Post-Capture 扩增循环数 |
捕获文库产出(ng) |
---|---|---|---|---|
Exome Plus Panel 2.0 |
~46 Mb |
1-plex(500 ng) |
8 |
~70 |
12-plex(6,000 ng) |
6 |
~200 |
||
NanOnco Plus Panel v2.0 |
~2.6 Mb |
1-plex(500 ng) |
10 |
~120 |
12-plex(6,000 ng) |
7 |
~80 |
||
NanoHema Research Panel v1.0 |
~1 Mb |
1-plex(500 ng) |
11 |
~70 |
12-plex(6,000 ng) |
7 |
~80 |
||
NanOnCT Panel v1.0 |
~0.4 Mb |
1-plex(500 ng) |
12 |
~80 |
12-plex(6,000 ng) |
8 |
~80 |
||
LungCancer Panel v1.0 |
~0.23 Mb |
1-plex(500 ng) |
14 |
~100 |
12-plex(6,000 ng) |
11 |
~70 |
捕获终文库得量与许多因素存在相关性,除去实验操作影响外,一般会有以下理论影响因素:样本类型、起始混杂文库总量、Panel大小、杂交时长、扩增循环数等。为获得良好的实验数据,在满足上机测序所需用量的前提下,应尽量控制捕获后扩增循环数。MGI测序平台需要在上机前对文库进行环化,接着再进行滚环式扩增成DNA纳米球(DNA Nanoball)的过程。故所需的上机文库总量高于Illumina® 平台(具体需要根据各测序仪型号以及测序公司要求决定)。根据NadPrep®通用环化试剂盒(for MGI)(货号:1002231)使用说明书V1.0版本描述,环化所需文库推荐投入量至少>1 pmol,因此我们推荐:
• 对于大型Panel的多样本混杂文库,由于可能所测数据量较多,建议至少需要满足>1 pmol的总量(>300 ng);
• 对于大型Panel的少量样本混杂文库,由于后续会与其他文库混合上机测序,所需文库总量可适当降低。但建议混合送测文库总量>1 pmol(>300 ng);
对于小型Panel的混杂文库,由于后续会与其他文库混合上机测序,所需文库总量可适当降低。但建议混合送测文库总量>1 pmol(>300 ng)。
基于上述总量,针对特定类型的Panel,可根据测试结果调整捕获后扩增循环数。针对纳昂达商品化Panel,可参考下表:
Panel名称 |
大小 |
混杂 |
Post-Capture扩增循环数 |
捕获文库产出(ng) |
Exome Plus Panel 2.0 |
~46 Mb |
1-plex(500 ng) |
8 |
~70 |
|
|
12-plex(6,000 ng) |
6 |
~200 |
NanOnco Plus Panel v2.0 |
~2.6 Mb |
1-plex(500 ng) |
10 |
~120 |
|
|
12-plex(6,000 ng) |
7 |
~80 |
NanoHema Research Panel v1.0 |
~1 Mb |
1-plex(500 ng) |
11 |
~70 |
|
|
12-plex(6,000 ng) |
7 |
~80 |
NanOnCT Panel v1.0 |
~0.4 Mb |
1-plex(500 ng) |
12 |
~80 |
|
|
12-plex(6,000 ng) |
8 |
~80 |
LungCancer Panel v1.0 |
~0.23 Mb |
1-plex(500 ng) |
14 |
~100 |
|
|
12-plex(6,000 ng) |
11 |
~70 |
针对NadPrep®系列产品,在文库构建及靶向捕获时的扩增引物如下:
接头类型 |
Pre-Capture 扩增引物 |
Post-Capture 扩增引物 |
测序平台 |
---|---|---|---|
NadPrep®UDI Adapter |
NadPrep®Amplification Primer Mix |
NadPrep®Amplification Primer Mix |
Illumina®平台 |
NadPrep®M-Adapter / BMI Adapter (SI) |
NadPrep®M-Index Primer Mix (SI) |
M-Amplification Primer Mix (SI) |
MGI平台 |
NadPrep®M-Adapter / BMI Adapter (DI) |
NadPrep®M-Index Primer Mix (MDI) |
M-Amplification Primer Mix (DI) |
MGI平台 |
NadPrep® Universal Stubby Adapter (UDI) |
NadPrep® Universal UDI-Index Primer Mix |
Amplification Primer Mix Ⅱ |
Illumina®/MGI 平台 |
NadPrep®通用型文库构建试剂盒(96 rxn)已包含 Pre/Post-Capture 的相关引物。其中 Post-PCR 引物均为 Illumina 或 MGI 平台通用引物,也可使用其它同类型产品替代。
为了解除带有生物素标记的文库与链霉亲和素磁珠的结合,可尝试使用以下二者操作之一(或参考 M270 磁珠官方建议):
• 溶于 10 mM EDTA、95% 甲酰胺、pH 8.2 的溶液中,混匀并于 65℃下加热 5 min或 90℃下加热 2 min;
• 溶于 0.1 % SDS,混匀并加热煮沸 5 min。
尽管杂交捕获体系已经过优化,适用于更短时间的杂交。但与 16 h 杂交相比,不同类型的 Panel 随着杂交时长的缩短,在捕获文库总量、捕获效率、覆盖均一性等方面皆存在不同程度的降低,详见下图。相比中大型 Panel(>0.4 Mb),小型 Panel(<0.4 Mb)受到的影响更大。对于有时效性要求的,可对大型 Panel 尝试缩短杂交时间,但不建议将此种情况用于小型 Panel。
产品 |
货号 |
NanOnCT Panel v1.0, 16 rxn |
1001902 |
NanOnCT Panel v1.0, 96 rxn |
1001901 |
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如果有任何问题,欢迎联系
400 8717 699 或 support@njnad.com。