适用于片段化后 DNA 分布范围较宽且期望得到稳定的数据产出的情况。但获得狭窄峰型也会降低文库丰度，故操作少量样本时应注意损耗。双筛分为片段化后双筛、连接后双筛两种。在双筛的过程中短片段损失更多但分布更集中，而长片段与之相反。由于连接后双筛时已引入了接头，因此相对片段化后双筛损失更少，但峰型相对较宽。此时还应注意：
• 任意形式的双筛都会带来 DNA 的损耗，因此扩增循环数需要至少增加 1 个循环；
• 任意形式的双筛都会带来原始文库丰度的损耗，可能会导致测序数据中的重复率的增加；
• 打断片段的平均大小应接近预期片段大小，以减少样本损失。
推荐以下操作以提高回收效率：适当增加孵育时间；适当提高磁珠纯化倍数（如纯化样本步骤，非片筛）；使用新鲜配制的 80% 乙醇。
支持。但仅适配于全长型接头，即 NadPrep® DNA 通用型文库构建试剂盒（for
Illumina®）搭配全长 NadPrep® UDI Adapter 进行文库构建。
文库长度分布可通过凝胶电泳、Bioanalyzer或者 Bioptic（Qsep）等生物分析系统进行检测，但应注意不同分析仪器的文库片段读数可能会存在一定的偏差。常见的异常文库片段分布原因如下：
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异常峰型 |
产生原因 |
解决办法 |
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有短片段（~100 bp）小峰 |
接头冗余 |
合适的Input DNA量和接头使用量；注意加样及连接条件 |
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有双峰（额外单个短片段峰） |
过度扩增 |
降低Input DNA量，降低扩增循环数 |
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额外有长片段峰 |
磁珠残留 |
纯化步骤时小心操作，以去除全部磁珠 |
试剂盒内 Ligation
Buffer、 DNA Ligase、End Repair &
A-Tailing Enzyme 等试剂较为黏稠，建议上下颠倒或反复轻弹融解混匀。操作过程中使用低吸附吸头，缓慢平稳吸取与释放。如吸头有试剂残留可反复吹吸或使用反向移液法，务必确保加液的准确性。