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- NEXome 只是减少了不必要的外显子侧翼覆盖，对于侧翼 20 bp 的覆盖是完全可以保证的。
- 如下图所示，测序数据共 10 G，insert size 236 bp 的数据中，99.7% 的外显子侧翼 20 bp 处达到 20x 覆盖，90% 外显子达到 53x，80% 达到 65x。
1、Intron 区 repeats 无法放置探针；
2、Intron 区跨度巨大，需放置大量探针;
搭配纳昂达自有 Panel
- Exome Plus Panel v2.0（全外）已经包含 HiSNP Panel；
- NanOnco Plus Panel v2.0 （泛癌）叠加 HiSNP Panel， 可用于计算 LOH。
其他 Customized Panel
咨询技术支持推荐如下：
• 对于 Size 分布均一、所需测序数据量相同的文库，一般在文库混杂投入比＞50 % 的前提下，推荐 500 ng/文库的投入量，以期提高文库丰富度，降低测序数据的重复率；
• 对于 Size 分布不均一、样本质量差异较大、所需测序数据量不同的文库，一般在文库混杂比＞50 % 的前提下，推荐按照摩尔量进行相应比例的混合。
注：1. 混杂投入比=样本进入杂交反应的文库量/样本实际文库构建产出总量*100 %；
2. moles of dsDNA (mol) = mass of dsDNA (g) / ((length of dsDNA (bp) x 617.96 g/mol) + 36.04 g/mol)
目前混合文库的浓缩推荐采用真空浓缩法或磁珠浓缩法，具体操作可参考DNA文库杂交捕获操作指南。相关测试结果表明不同浓缩法的结果基本一致，仅存在轻微GC差异偏好。但真空法更经济、操作简单，而磁珠法则可适配自动化工作站，可根据具体情况进行选择：
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浓缩方式 |
优点 |
缺点 |
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真空浓缩 |
操作简便、时间可控、损失低 |
需要真空浓缩仪 |
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磁珠浓缩 |
无需另购仪器、可适配自动化工作站 |
存在DNA损失且需求试剂量增加、存在GC偏好性 |
捕获终文库得量与许多因素存在相关性，除去实验操作影响外，一般会有以下理论影响因素：样本类型、起始混杂文库总量、Panel 大小、杂交时长、扩增循环数等。为获得良好的实验数据，在满足上机测序所需用量的前提下，应尽量控制捕获后扩增循环数。Illumina®平台在上机测序前会对文库进行指数式扩增的成簇反应，故所需的上机文库总量较低（具体需要根据各测序仪型号以及测序公司要求决定）。对于不同 Panel，可在实验初期参考以下推荐列表，后期再根据具体结果进行调整：
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Panel大小 |
1-plex （500 ng） |
4-plex （2,000 ng） |
8-plex （4,000 ng） |
12-plex （6,000 ng） |
|---|---|---|---|---|
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＞10 Mb |
10 cycles |
8 cycles |
7 cycles |
6 cycles |
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1 Mb-10 Mb |
12 cycles |
10 cycles |
9 cycles |
8 cycles |
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50 Kb- 1Mb |
13 cycles |
11 cycles |
10 cycles |
10 cycles |
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1 Kb-50 Kb |
14 cycles |
12 cycles |
11 cycles |
11 cycles |
针对纳昂达商品化 Panel，可参考下表进行选择：
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Panel名称 |
大小 |
混杂 |
Post-Capture 扩增循环数 |
捕获文库产出（ng） |
|---|---|---|---|---|
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Exome Plus Panel 2.0 |
~46 Mb |
1-plex（500 ng） |
8 |
~70 |
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12-plex（6,000 ng） |
6 |
~200 |
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NanOnco Plus Panel v2.0 |
~2.6 Mb |
1-plex（500 ng） |
10 |
~120 |
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12-plex（6,000 ng） |
7 |
~80 |
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NanoHema Research Panel v1.0 |
~1 Mb |
1-plex（500 ng） |
11 |
~70 |
|
12-plex（6,000 ng） |
7 |
~80 |
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NanOnCT Panel v1.0 |
~0.4 Mb |
1-plex（500 ng） |
12 |
~80 |
|
12-plex（6,000 ng） |
8 |
~80 |
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LungCancer Panel v1.0 |
~0.23 Mb |
1-plex（500 ng） |
14 |
~100 |
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12-plex（6,000 ng） |
11 |
~70 |