新品上线 | μCaler® 甲基化检测助力实现多癌种早筛新突破 (上)

01 癌症早筛现状

1.1 早筛是提高癌症患者生存率的重要手段

国家癌症中心的数据显示，2020 年中国癌症新发 456.9 万例，死亡 300.3 万例，分别占全球比例的 23.7% 和 30%，中国已成为全球癌症新发和死亡第一“大国”。另外，中国癌症患者的总体五年生存率与美国存在较大差距。这是由于癌症筛查比例严重不足，多数患者确诊时已是中晚期，导致治疗效果不佳 (图 1.)。

 

 

图 1. 中国癌症筛查现状。 A.中国 & 美国癌症五年生存率对比； B. 国内癌症筛查现状[1]。

1.2 DNA 甲基化是癌症早筛指标“潜力股”

临床上可用于癌症早期筛查的潜在标志物众多，包括蛋白质、片段化组学、小分子代谢物、miRNA、ctDNA (circulating tumor DNA) 突变和 ctDNA 甲基化等。其中 DNA 甲基化状态的改变几乎出现在所有癌症的癌前病变及癌症早期阶段，是目前最有前景的多癌种早筛标志物。ctDNA 甲基化作为癌症早筛标志物，具有以下优势：信号丰富度高且稳定；器官特异性强，可实现组织溯源；基因组上成簇分布，具有更高的信噪比。

 

 

图 2. ctDNA 甲基化应用于癌症早筛标志物。A. DNA 甲基化异常发生在癌症早期阶段[2]；B. ctDNA 甲基化用于癌症组织溯源[3]。

DNA 甲基化检测有多种技术路线，如亚硫酸氢盐全基因组测序 (WGBS)、简化亚硫酸氢盐测序 (RRBS)、450/850K 芯片、液相杂交捕获技术的靶向甲基化测序 (杂交捕获测序)、多重 PCR 扩增测序 、焦磷酸测序、质谱和甲基化特异性 PCR (MSP) 等。目前，基于甲基化早筛的产品多以 MSP、多重 PCR 扩增测序和杂交捕获测序的技术路线为主 (表 1.)。

表 1. 甲基化早筛产品的技术路线。

 

NMPA 已批复的 19 种单癌种甲基化检测产品均是 MSP 法。这种方法仅对少量基因甲基化状态的定性检测，操作简单便捷且成本低廉。但是引物设计难度较大，检测结果容易出现假阳性。

多重 PCR 扩增测序和杂交捕获测序可同时检测多个 CpG 位点甲基化状态，因此更适用于多癌症早筛。但是多重 PCR 扩增测序难点依然在于引物设计难度大，尤其是连续的 CpG 位点。杂交捕获测序法适用于不同甲基化状态的靶标捕获，潜在应用范围更为广泛。

02 μCaler® 靶向甲基化测序解决方案

2.1 方案简介

纳昂达即将推出全球独创的 μCaler® 靶向甲基化测序解决方案，这一自主创新性方案采用了独家专利的 μCaler® 杂交捕获系统，旨在为用户提供精准、稳定、高效、快速、简单的甲基化测序的全新体验。

① 独家专利的 μCaler® 技术：该方案搭载全球独创型 μCaler® 技术，优化的杂交捕获体系和专利型探针设计方案，确保对转化后的甲基化文库的高效捕获和不同甲基化状态的精准检测。这一专利技术的运用为用户提供了更加全面和精准的甲基化信息。

② 特殊区域的优化：该解决方案针对甲基化文库优化的杂交捕获体系不仅适配于 mini Panel 的稳定捕获，还特别适用于 AT-rich 等特殊区域的捕获。这使得对于复杂基因组区域的分析更加全面。

③ 单日完成全流程：该解决方案不仅具备稳定高效性，而且能够在单日内完成甲基化捕获文库的全流程，为用户提供极大的便捷性，带来前所未有的高速体验。

 

图 3. μCaler® 靶向甲基化测序方案全流程。

2.2 方案特色

• 精准检测大规模 CpG 位点：一次性检测多种癌症的多个基因的 CpG 位点，实现精准联合检测；

• 精确定量甲基化水平：高精度覆盖 0-100% 不同甲基化状态样本的精准定量；

• 高速便捷操作：实验流程简化，操作便捷，单日内完成全部流程；

• 稳定高效捕获：避免数据量不一致，确保捕获测序结果的稳定性，降低返工风险；

• 更低测序成本：采用混杂模式，简化杂交捕获数量，降低测序成本，提升经济效益；

• 稳定交付周期：自有核酸合成工厂，现货交付，保障交付周期的稳定性。

2.3 方案表现

2.3.1 稳定高效捕获

利用 μCaler® 甲基化杂交体系对单文库的不同杂交投入量 (500 ng-3,000 ng) 的捕获结果显示，捕获数据比对率稳定维持在 99% 以上，中靶率保持 50% 以上。此外，CpG 位点的覆盖均一性较优，0.2x mean CpG Coverage 均 ＞99%。这表明，μCaler® 甲基化杂交体系支持 500 ng-3,000 ng 文库的投入。

 

 

 

 

图 4. μCaler® 靶向甲基化测序解决方案的捕获表现。人类基因组 DNA 标准品 (Promega, G1471) 利用 NadPrep® Methyl Library Preparation Module 搭配 NadPrep® Methyl Stubby Adapter (UDI) Module (with 10 nt Index) 和 NadPrep® DNA Methyl Bisulfite Conversion Module 构建预文库，以 μCaler® Methyl Cervical Cancer Panel 完成杂交捕获。 A.比对率和中靶率；B. CpG 位点的覆盖均一性；C. CpG 位点的甲基化水平；D. C 碱基转化率。

注：μCaler® Methyl Cervical Cancer Panel 覆盖区域约 1.4 Kb，包含 125 个 CpG 位点。

2.3.2 精确定量甲基化水平

焦磷酸测序 (Pyro) 利用酶联化学发光反应，能够快速检测 CpG 位点甲基化水平，是甲基化检测的“金标准”。因此，可用于对 μCaler® 靶向甲基化测序的准确性对比验证。

我们按不同比例混合甲基化阳性对照 (Methylated DNA, Zymo, D5014-2) 与阴性对照 (Non-Methylated DNA, Zymo, D5014-1)，以模拟不同甲基化水平。之后利用 μCaler® 靶向甲基化测序 (μCaler) 和焦磷酸测序 (Pyro) 分别对模拟样本进行多基因多 CpG 位点 (基因 MGMT、Septin9 和 BMP3 的 38 个 CpG 位点) 的甲基化水平的检测。结果显示，焦磷酸测序对 0%、2% 及 100% 样本的检测结果出现了明显偏差。而 μCaler 对不同甲基化水平样本的检测均更为精准。这表明 μCaler 检测结果能够化反应样本真实甲基状态，可广泛应用于表观遗传学层面的研究。

焦磷酸测序以转化后的产物为模板进行扩增，CpG 位点转化后变成 AT 或者是 GC Rich 的区域，扩增引物以及测序引物对于不同 GC 含量的模板具有一定的偏好性，导致低甲基化以及高甲基化水平的样本偏离真实水平。μCaler® 针对转化后的模板设计探针，采用穷尽法探针设计思路，捕获所有甲基化状态的靶标，通用引物扩增文库测序，对不同甲基化水平样本的检测更为精准。

图 5. 模拟样本经不同方法检测的甲基化水平。A-E 分别为 0%，2%，10%，50% 和 100% 不同甲基化水平的模拟样本。其中焦磷酸测序 Input 量为 200 ng，μCaler® 靶向甲基化测序 Input 量为 25 ng。

我们将在下篇中展示更多性能表现及真实样本应用示例，敬请关注！

 

 

参考文献

[1] Xia C, Basu P, Kramer B S, et al. Cancer screening in China: a steep road from evidence to implementation[J]. The Lancet Public Health, 2023.

[2] Robertson K D. DNA methylation and human disease[J]. Nature Reviews Genetics, 2005, 6(8): 597-610.

[3] Oxnard G R, Klein E A, Seiden M V, et al. Simultaneous multi-cancer detection and tissue of origin (TOO) localization using targeted bisulfite sequencing of plasma cell-free DNA (cfDNA)[J]. Annals of Oncology, 2019, 30: v912.