【指南发布】CNV分析怎么做？看看这些实用建议！

拷贝数变异（Copy Number Variations， CNV）是由于基因组上存在1 kb以上的片段复制或缺失异常而导致的。现有研究表明， CNV 涉及到多种人类疾病的分子机制。对肿瘤患者进行 CNV 分析不仅可为肿瘤分子分型、用药、预后等临床管理提供指导，还有助于发现潜在的致病基因，为靶向药的开发提供新思路^[1]。

全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS）已逐渐取代 SNP 芯片成为 CNV 分析金标准^[2]。考虑到肿瘤标本的倍性、纯度和异质性，为了满足高覆盖率和低成本的要求，基于二代测序（Next-generation Sequencing, NGS）的靶向分析，如外显子测序（Whole Exome Sequencing, WES）和特定区域靶向测序（Targeted Next-Generation Sequencing, Tg-NGS），正越来越多地应用于 CNV 检测。

为了评估多款 Panel 产品用于 CNV 分析的表现，并对使用不同 Panel 进行 CNV 评估提出建议，以达到为用户提供参考价值的目标，纳昂达利用肿瘤 CNV 标准品和真实肿瘤样本（胰腺癌和结直肠癌组织）分别对多款 Panel 评估 CNV 的能力进行了分析，并对各影响条件给出相应的分析建议。

CNV分析简介

目前基于 NGS 的靶向捕获检测 CNV 主要依靠 Read-Depth 方法，即基因组区域的覆盖深度与拷贝数之间的关联性。根据检测方式可分为三类：单样本，配对的样本和对照，以及样本和群体正常参考对照。单样本分析由于没有参考对照，仅能检测与参考基因组相比较下的绝对拷贝数；配对样本分析时，可检测与对照相比较下的相对拷贝数差异；而基于人群的研究中，正常样本组的分布可用于分析检测肿瘤样本中的CNVs。

分析材料与方案

材料来源：肿瘤CNV标准品（肿瘤结构变异5% gDNA标准品和肿瘤野生型 gDNA 标准品，菁良，货号分别为 GW-OGTM001、GW-OGTM005）和真实肿瘤样本（2 例胰腺癌和6 例结直肠癌样本）的 WES 和 Tg-NGS 均在 Illumina 和 MGISEQ 双平台上进行。

分析方法：已知拷贝数来源于数字 PCR 或低深度 WGS（～350bp insert size）。CNVkit、Varscan2、cnv_facets 用于 WES 数据的 CNV 分析；CoNVaDING 和 DECoN 软件用于 Tg-NGS 数据的 CNV 分析；TitanCNA 用于 WGS 数据的 CNV 分析，具体软件信息见表1。

表1. 分析软件列表

通过此次分析评估，我们发现 CNV 在染色体上多呈现大片段（>1kb）异常，因此捕获 Panel 的大小和区域设计分布影响 Tg-NGS 下的 CNV 检测。对于 WGS、WES、Tg-NGS 涵盖不同大小的染色体区域的NGS技术，检测对应数据中 CNV 时应使用相符合的软件。我们的评估结果软件或算法以及判读定义都会影响 CNV 检出的效率及准确性。

对于 WES 数据检测 CNV，我们建议：1）按照软件要求提供对照样品数，一般情况下对照数据集应≥1。CNVkit 软件要求对照样本≥1，Varscan2 和 cnv_facets 要求肿瘤与对照配对分析；2）测序深度应满足软件分析要求；3）根据数据集训练结果合理自定义拷贝数扩增和缺失的阈值；4）使用多个 CNV 检测软件互补分析。

更多实验详情及分析总结，联系我们 support@njnad.com，获得 NAD-CNV 分析指南白皮书。

参考文献

[1] Kumaran M, Cass C E, Graham K, et al. Germline copy number variations are associated with breast cancer risk and prognosis[J]. Scientific reports, 2017, 7(1): 1-15.

[2] Zhou B, Ho S S, Zhang X, et al. Whole-genome sequencing analysis of CNV using low-coverage and paired-end strategies is efficient and outperforms array-based CNV analysis[J]. Journal of medical genetics, 2018, 55(11): 735-743.