新品上线 | RNA & DNA 病原共检 更高效的 tNGS 全矩阵解决方案

01 背景

由病原微生物引起的感染性疾病是导致人类高死亡率和高发病率的重要疾病之一。病原感染类型种类繁多，包括寄生虫、真菌、细菌、支原体/衣原体/螺旋体/立克次氏体、病毒等。不同病原感染通常需要特定的诊疗措施，故快速准确地检测是诊断治疗与管理的关键。

RNA 病毒易被漏检且多系统常见混合感染，其中呼吸系统常见双病原混合感染，主要模式有病毒合并病毒、病毒合并细菌、肺炎支原体合并病毒，占比 15.8%~31%。据中国疾病预防控制中心 2021 年底发布的共计 233,037 例呼吸道感染的监测数据^[1]，引起急性呼吸道感染的 8 种病毒中，Top 4 均为 RNA 病毒：流感病毒 (IFV)、呼吸道合胞病毒 (RSV)、鼻病毒 (HRV) 和副流感病毒 (HPIV)。那么，是否有必要进行 RNA & DNA 共检？哪些人群适用于 RNA & DNA 共检呢？

DNA 检测流程适用于疑似 DNA 病原体感染时，如细菌、真菌、寄生虫、DNA 病毒等，尤其是胞内寄生的细菌 (结核分枝杆菌) 和细胞壁较厚的真菌 (隐球菌)。RNA 检测流程适用于疑似 RNA 病毒感染时，如流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒等 RNA 病毒。当病毒感染难以排除时，则建议同时进行 RNA 和 DNA 检测。

RNA & DNA 双流程检测成本高，亟需 RNA & DNA 单管共建库方案以降低检测成本，缩短检测时间。结合病原微生物靶向测序 (tNGS)，更好地助力临床感染快速精准诊疗。

 

02 RNA & DNA 共检 tNGS 全矩阵解决方案

2.1 方案流程

纳昂达提供端到端的 tNGS 病原微生物检测全矩阵解决方案，包括：NadAuto 系列自动化工作站、RNA & DNA 共建库试剂盒、双测序平台多类型接头、快速杂交捕获试剂、封阻序列、NEX-t 杂交捕获探针、可视化生信分析平台及报告解读。整体方案全流程仅需 14 hr：核酸提取 (约 1.5 hr)、RNA & DNA 共建库 (约 3 hr)、杂交捕获 (约 4 hr)、NGS 测序 (约 5 hr)、生信分析及自动化解读报告 (约 0.5 hr)。

 

图 1. 病原微生物 tNGS 检测全矩阵解决方案

 

2.2 方案特色

① RNA & DNA 共建库

•单个流程实现 RNA & DNA 共检：一次建库流程同时检测 RNA & DNA 病原微生物，防止漏检

•灵活兼容不同样本类型：适应多场景应用，灵活兼容不同临床样本类型

② NEX-t 杂交捕获

•单次检测实现病原谱广覆盖：NEX-t 探针设计覆盖 450+ 属病原体，满足临床 99% 以上检测需求

•正向富集提升检测灵敏度：排除宿主背景干扰，显著提升目标病原体检测的灵敏度

•提升耐药/毒力基因检测能力：NEX-t 探针设计覆盖耐药、毒力相关基因，深度捕获变异，助力临床感染精准诊疗

③ XCapViz 可视化生信分析平台

•XCapViz 提供智能、快速的生信分析，一键式生成检测报告

•数据分析和分析流程本地化，保证数据的安全性

 

03 RNA & DNA 共建库

3.1 产品简介

纳昂达已于 2023 年 9 月推出靶向病毒、细菌、真菌、寄生虫以及看家基因、耐药相关基因的病原检测 Panel -- NEX-t Panel v1.0 (新品上线 | NEX-t Panel：更精准、更经济的 tNGS 病原检测方案)。该 Panel 通过充分利用探针容错性的优势，在保证富集信息量的同时，将 Panel 规模精简至约 8,000 条探针，降低了应用门槛。

NadPrep^® RNA & DNA Library Co-Preparation Module，是针对 Illumina & MGI 高通量测序平台开发的 RNA & DNA 共建库模块，可以实现在单个反应体系内同时完成对 RNA 样本的高效双链 DNA 转化、双链 DNA 和 DNA 样本的片段化、末端修复和加 A，适用于 10-100 ng RNA 与 1-100 ng DNA 的混合病原微生物样本测序。利用该模块构建的预文库衔接 NEX-t Panel v1.0 和 NadPrep^® ES Hybrid Capture Reagents，为 tNGS 检测提供更快速、更精准、更经济的解决方案。

 

图2. NadPrep^® RNA & DNA Library Co-Preparation Module 实验流程

 

3.2 产品特色

 

图 3. NadPrep^® RNA & DNA Library Co-Preparation Module 产品特色

 

04 方案表现

4.1 灵活兼容不同 RNA & DNA 比例的混合样本

在常规的病原检测流程中，通常需要分别对临床样本中的 RNA 和 DNA 进行建库。然而，面对珍贵的样本、疑似混合感染或检测时间紧迫等场景，多方检测平台以及专家指南都推荐将 RNA 与 DNA 联合检测，这有望更大程度地提高临床获益率。我们以不同投入量的 K562 细胞系 RNA 和人类基因组 DNA 标准品 (Promega, G1521) 混合样本为起始模板，采用 NadPrep^® RNA & DNA 共建库模块进行文库构建。结果显示，在不同混合比例和不同投入量的 RNA & DNA 模板下，无论是在 Illumina 还是 MGI 平台上，都能够高效稳定地进行文库构建和片段化。

 

 

 

 

图 4. NadPrep^® RNA & DNA Library Co-Preparation Module 对不同比例起始量 RNA & DNA 混合样本的建库表现。利用 NadPrep^® RNA & DNA Library Co-Preparation Module 分别搭配 NadPrep^® Universal Adapter (MDI) Module (for MGI) 和 NadPrep^® Universal Stubby Adapter (UDI) Module 进行文库构建。A & C. 文库产出和峰形 (MDI)；B & D. 文库产出和峰形 (UDI)。

 

4.2 支持双测序平台 tNGS 解决方案

由于 tNGS 技术在检测上具有更高的灵敏度和更低的成本，在临床应用上受到广泛的关注。我们以模拟病原微生物样本采用 NadPrep^® RNA & DNA 共建库模块构建预文库，衔接 NadPrep^®️ ES Hybrid Capture Reagents 和 NEX-t Panel v1.0 完成杂交捕获，杂交时间为 2 hr。结果显示，采用 NadPrep^® RNA & DNA 共建库模块构建的文库在 Illumina 和 MGI 测序平台均可有效检出病原微生物。

 

 

 

 

图 5. NadPrep^® RNA & DNA tNGS 全流程解决方案在双测序平台的检出情况。A. 捕获数据的比对率；B. Coronavirus (冠状病毒) reads 分布；C. Candida albicans (白色念珠菌) reads 分布；D. rRNA reads 分布。

注：横坐标标注表示拟宿主混合核酸样本起始投入量：掺入病原混合核酸样本起始投入量。拟宿主混合核酸样本为 Human Brain Total RNA 标准品 (Clontech, 636530) 和人类基因组 DNA 标准品 (Promega，G1521) 以 1:1 进行混合。掺入病原混合核酸样本为新型冠状病毒奥密克戎突变株基因组 RNA 标准物质 (中国计量科学研究院， NIM-RM 5225；1 pg 为 50 copies) 和 Candida albicans 标准品 (ATCC, 10231；1 pg 为 6000 copies) 以 1:1 进行混合。

 

4.3 tNGS 有效提升检测灵敏度

4.3.1 tNGS vs mNGS

在感染性疾病的诊断中，通常需要对致病病原体进行简单快速准确的鉴定。然而，由于 mNGS 技术具有几乎全谱的微生物覆盖，其结果解读较为复杂，而且对于低载量微生物的检测能力相对较弱。相比之下，tNGS 技术具有相对广谱、覆盖临床感染 95% 以上常见病原、对低载量病原进行有效富集的优势，从而弥补了当前感染性疾病检测的不足之处，提升了检测结果的可信度。我们测试了相同测序数据量 (0.5 Gb) 下，分别采用 tNGS 和 mNGS 两种技术方案对病原微生物进行检测，结果表明，tNGS 方案可有效富集低载量病原微生物信息。

 

 

图 6. 基于 NadPrep^® RNA & DNA Library Co-Preparation Module 分别采用 tNGS 和 mNGS 对模拟病原微生物样本的检出 reads 分布。A. Coronavirus (冠状病毒) reads 分布；B.Candida albicans (白色念珠菌) reads 分布。

注：测序模式为 Illumina Novaseq 6000，PE150。

 

4.3.2 有效提升 RNA 病毒检测灵敏度

RNA & DNA 共建库的另一个备受关注的问题是对 RNA 病毒的检测。我们以相同的模拟病原微生物 RNA 样本分别采用 NadPrep^® RNA & DNA 共建库模块 (共建库，Co-Prep) 和 NadPrep^®️ Total RNA-To-DNA Module 衔接 NadPrep^® DNA 通用型文库构建试剂盒 (单建库，RNA-Prep) 进行预文库构建，以 NEX-t Panel v1.0 完成杂交捕获。选取相同数据量进行分析。结果表明，两种建库方式对 RNA 病毒的检测结果一致。

 

 

图 7. 共建库与单建库对不同拷贝数的 RNA 混合样本的的捕获表现。A. 捕获数据 reads 分布；B. 富集倍数。

注：横坐标为新型冠状病毒奥密克戎突变株基因组 RNA 标准物质样本的拷贝数。样本来源于 Human Brain Total RNA 标准品 (Clontech, 636530) 和不同拷贝数的 RNA 病毒样本的混合物。

 

4.3.3 有效提升 DNA 病原检测灵敏度

我们以相同的模拟病原微生物 DNA 样本分别采用 NadPrep® RNA & DNA 共建库模块 (共建库，Co-Prep) 和 NadPrep® 快速 DNA 酶切文库构建试剂盒 (单建库，DNA-Prep) 进行预文库构建，以 NEX-t Panel v1.0 完成杂交捕获。选取相同数据量比较分析两种建库方式去重后的覆盖深度，结果显示 DNA 病原检出情况一致。

 

图 8. 共建库与单建库对不同微生物含量的模拟菌群样本的捕获后覆盖深度。

注：样本来源为以人类基因组 DNA 标准品 (Promega，G1521) 按照不同比例对 20 菌株交错的混合基因组材料 (ATCC，MSA-1003) 进行稀释，以获得 0.001%-1% MSA-1003 的模拟菌群。

 

4.4 低 GC 偏好性

我们对比了 NadPrep^® RNA & DNA 共建库模块和其他供应商 A* & B* 在不同 GC 微生物群组样本的检测效果。结果显示，NadPrep^® RNA & DNA 共建库模块无明显 GC 偏好。

 

图 9. NadPrep^® RNA & DNA Library Co-Preparation Module 对宏基因组样本的建库表现。A. 金黄色葡萄球菌，B. 枯草芽孢杆菌和 C. 发酵乳杆菌等不同 GC 含量的全基因组文库的 GC 偏好性。

 

4.5 临床真实样本捕获表现

我们对比了 NadPrep^® RNA & DNA 共建库模块和其他供应商 A* & B* 在真实鼻病毒样本的检测效果。结果显示，NadPrep^® RNA & DNA 共建库试剂盒对鼻病毒检测灵敏度优势明显。

 

 

图 10. NadPrep^® RNA & DNA tNGS 全流程解决方案对真实样本的检测表现。A. 文库产出；B. Rhinovirus A 和 Rhinovirus C reads 占比。

 

05 总结

随着 NadPrep^® RNA & DNA 共建库模块的正式推出，结合高效精简的 NEX-t Panel v1.0，快速稳定的 NadPrep^®️ ES Hybrid Capture Reagents，以及可视化生信分析平台和自动化解读报告，纳昂达可以提供病原微生物检测端到端 tNGS 全矩阵解决方案。该方案不仅降低了检测成本，缩短检测时间，还提高了检测效率，为临床感染快速精准诊疗提供有力支持。

 

 

参考文献

[1] Li Z J, Zhang H Y, Ren L L, et al. Etiological and epidemiological features of acute respiratory infections in China[J]. Nature communications, 2021, 12(1): 5026.