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解决方案

NanoHema Research Panel

货号：

#1001704 (16 rxn)
#1001705 (96 rxn)

NanoHema Research Panel v1.0 是一款用于血液肿瘤研究分析的基础型 Panel。靶向精选的血液肿瘤相关基因，包含《二代测序技术在血液肿瘤中的应用中国专家共识（2018 年版）》中 106 个基因的全部编码区域。该 Panel覆盖基因组约 1.03 Mb 区域，涉及 266 个基因，支持包括碱基替换，插入 / 缺失，基因重排，基因扩增在内的多种变异信息的富集。

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基因列表

ABL1	ANKRD26	APC	ARAF	ARC	ARID1A	ARID1B	ARID2	ARID5B	ASXL1
ASXL2	ASXL3	ATG2B	ATG5	ATM	ATRX	B2M	BCL2	BCL6	BCOR
BCORL1	BIRC3	BLM	BLNK	BRAF	BRCA1	BRCA2	BRCC3	BTG1	BTG2
BTK	CALR	CARD11	CBFB	CBL	CCND1	CCND2	CCND3	CCR4	CCR7
CD274	CD28	CD58	CD79A	CD79B	CDKN1A	CDKN2A	CDKN2B	CDKN2C	CEBPA
CEBPE	CHD8	CIITA	CRBN	CREBBP	CRLF2	CSF1R	CSF3R	CSMD1	CTCF
CTLA4	CTNNB1	CUL4B	CXCR4	CYLD	DDX3X	DDX41	DHX15	DIS3	DNM2
DNMT3A	DPF1	DPF2	DPF3	DUSP22	DUX4	EBF1	ECT2L	EED	EGFR
EGR2	EIF2A	EP300	EPCAM	EPHA7	EPOR	ERBB3	ERG	ETNK1	ETV6
EZH2	FAM46C	FAS	FAT1	FBXW7	FGFR1	FGFR3	FLT3	FOXO1	FOXO3
FYN	GATA1	GATA2	GATA3	GLTSCR1	GNA13	GNAI2	GSKIP	HACE1	HNRNPA2B1
HRAS	ID3	IDH1	IDH2	IFNLR1	IGLL5	IKZF1	IKZF2	IKZF3	IL7R
INO80	INPP5D	IRF4	ITK	ITPKB	JAK1	JAK2	JAK3	KANSL1	KDM6A
KIT	KLF2	KMT2A	KMT2B	KMT2C	KMT2D	KRAS	LMO2	LTB	MAFA
MAFB	MALT1	MAP2K1	MAPK1	MECOM	MED12	MEF2B	MEF2D	MET	MFHAS1
MGA	MICRO142	MLH1	MPL	MSH2	MSH6	MTOR	MYBBP1A	MYC	MYD88
NF1	NFKB1	NFKB2	NFKBIE	NOTCH1	NOTCH2	NPM1	NRAS	NT5C2	NTRK3
P2RY8	PAX5	PBRM1	PBX1	PDCD1LG2	PDGFRA	PDGFRB	PHF6	PIGA	PIK3CA
PIM1	PLCG1	PLCG2	PML	PMS2	POT1	PPM1D	PRDM1	PRKCB	PTEN
PTK2B	PTPN1	PTPN11	PTPRD	PTPRK	RAD21	RAF1	RARA	RB1	REL
RELA	RELB	RELN	RET	RHOA	RNF4	RPS15	RRAGC	RUNX1	SAMD9
SAMD9L	SAMHD1	SETBP1	SETD2	SF1	SF3B1	SGK1	SH2B3	SH2D1A	SMARCA2
SMARCA4	SMARCB1	SMC1A	SMC2	SMC3	SOCS1	SOS1	SPEN	SRP72	SRSF2
STAG2	STAT1	STAT2	STAT3	STAT4	STAT5A	STAT5B	STAT6	SUZ12	SYK
TBL1XR1	TCF3	TERT	TET1	TET2	TNFAIP3	TNFRSF14	TNFRSF1B	TP53	TP63
TP73	TRAF3	TYK2	U2AF1	UNC13D	VAV1	VHL	VPREB1	WT1	XPO1
ZAP70	ZBTB7A	ZEB2	ZMYM3	ZNF292	ZRSR2

产品表现

图1. NanoHema Research Panel v1.0 覆盖均一。取 0.5 M Read pairs 进行分析，99% 以上靶区覆盖深度超过 0.2 x 平均测序深度。

图2. NanoHema Research Panel v1.0 不同 GC 含量探针对 gDNA 的捕获表现。取 0.5 M Reads pairs 进行分析，覆盖均一，变异系数小。

本产品仅限研究使用，不用于临床诊断。

货号

管盖

颜色

产品名称

包装

体积

包装/储存温度

1001704

NanoHema Research Panel v1.0, 16 rxn

70 μL

-20℃

1001705

NanoHema Research Panel v1.0, 96 rxn

415 μL

-20℃

多文库的混合捕获实验，对于文库投入量推荐？

推荐如下：

• 对于 Size 分布均一、所需测序数据量相同的文库，一般在文库混杂投入比＞50 % 的前提下，推荐 500 ng/文库的投入量，以期提高文库丰富度，降低测序数据的重复率；

• 对于 Size 分布不均一、样本质量差异较大、所需测序数据量不同的文库，一般在文库混杂比＞50 % 的前提下，推荐按照摩尔量进行相应比例的混合。

注：1. 混杂投入比=样本进入杂交反应的文库量/样本实际文库构建产出总量*100 %；

2. moles of dsDNA (mol) = mass of dsDNA (g) / ((length of dsDNA (bp) x 617.96 g/mol) + 36.04 g/mol)

杂交捕获前，对于混合文库的浓缩，是否有具体推荐？

目前混合文库的浓缩推荐采用真空浓缩法或磁珠浓缩法，具体操作可参考DNA文库杂交捕获操作指南。相关测试结果表明不同浓缩法的结果基本一致，仅存在轻微GC差异偏好。但真空法更经济、操作简单，而磁珠法则可适配自动化工作站，可根据具体情况进行选择：

浓缩方式	优点	缺点
真空浓缩	操作简便、时间可控、损失低	需要真空浓缩仪
磁珠浓缩	无需另购仪器、可适配自动化工作站	存在DNA损失且需求试剂量增加、存在GC偏好性

Illumina®平台捕获后扩增时，针对不同 Panel 产品是否可提供具体循环数推荐？

捕获终文库得量与许多因素存在相关性，除去实验操作影响外，一般会有以下理论影响因素：样本类型、起始混杂文库总量、Panel 大小、杂交时长、扩增循环数等。为获得良好的实验数据，在满足上机测序所需用量的前提下，应尽量控制捕获后扩增循环数。Illumina®平台在上机测序前会对文库进行指数式扩增的成簇反应，故所需的上机文库总量较低（具体需要根据各测序仪型号以及测序公司要求决定）。对于不同 Panel，可在实验初期参考以下推荐列表，后期再根据具体结果进行调整：

Panel大小	1-plex （500 ng）	4-plex （2,000 ng）	8-plex （4,000 ng）	12-plex （6,000 ng）
＞10 Mb	10 cycles	8 cycles	7 cycles	6 cycles
1 Mb-10 Mb	12 cycles	10 cycles	9 cycles	8 cycles
50 Kb- 1Mb	13 cycles	11 cycles	10 cycles	10 cycles
1 Kb-50 Kb	14 cycles	12 cycles	11 cycles	11 cycles

针对纳昂达商品化 Panel，可参考下表进行选择：

Panel名称	大小	混杂	Post-Capture 扩增循环数	捕获文库产出（ng）
Exome Plus Panel 2.0	~46 Mb	1-plex（500 ng）	8	~70
Exome Plus Panel 2.0	~46 Mb	12-plex（6,000 ng）	6	~200
NanOnco Plus Panel v2.0	~2.6 Mb	1-plex（500 ng）	10	~120
NanOnco Plus Panel v2.0	~2.6 Mb	12-plex（6,000 ng）	7	~80
NanoHema Research Panel v1.0	~1 Mb	1-plex（500 ng）	11	~70
NanoHema Research Panel v1.0	~1 Mb	12-plex（6,000 ng）	7	~80
NanOnCT Panel v1.0	~0.4 Mb	1-plex（500 ng）	12	~80
NanOnCT Panel v1.0	~0.4 Mb	12-plex（6,000 ng）	8	~80
LungCancer Panel v1.0	~0.23 Mb	1-plex（500 ng）	14	~100
LungCancer Panel v1.0	~0.23 Mb	12-plex（6,000 ng）	11	~70

MGI 平台捕获后扩增时，针对不同 Panel 产品是否可提供具体循环数推荐？

捕获终文库得量与许多因素存在相关性，除去实验操作影响外，一般会有以下理论影响因素：样本类型、起始混杂文库总量、Panel大小、杂交时长、扩增循环数等。为获得良好的实验数据，在满足上机测序所需用量的前提下，应尽量控制捕获后扩增循环数。MGI测序平台需要在上机前对文库进行环化，接着再进行滚环式扩增成DNA纳米球（DNA Nanoball）的过程。故所需的上机文库总量高于Illumina® 平台（具体需要根据各测序仪型号以及测序公司要求决定）。根据NadPrep®通用环化试剂盒（for MGI）(货号：1002231）使用说明书V1.0版本描述，环化所需文库推荐投入量至少＞1 pmol，因此我们推荐：

• 对于大型Panel的多样本混杂文库，由于可能所测数据量较多，建议至少需要满足＞1 pmol的总量（＞300 ng）；

• 对于大型Panel的少量样本混杂文库，由于后续会与其他文库混合上机测序，所需文库总量可适当降低。但建议混合送测文库总量＞1 pmol（＞300 ng）；

对于小型Panel的混杂文库，由于后续会与其他文库混合上机测序，所需文库总量可适当降低。但建议混合送测文库总量＞1 pmol（＞300 ng）。

基于上述总量，针对特定类型的Panel，可根据测试结果调整捕获后扩增循环数。针对纳昂达商品化Panel，可参考下表：

Panel名称	大小	混杂	Post-Capture扩增循环数	捕获文库产出（ng）
Exome Plus Panel 2.0	~46 Mb	1-plex（500 ng）	8	~70
		12-plex（6,000 ng）	6	~200
NanOnco Plus Panel v2.0	~2.6 Mb	1-plex（500 ng）	10	~120
		12-plex（6,000 ng）	7	~80
NanoHema Research Panel v1.0	~1 Mb	1-plex（500 ng）	11	~70
		12-plex（6,000 ng）	7	~80
NanOnCT Panel v1.0	~0.4 Mb	1-plex（500 ng）	12	~80
		12-plex（6,000 ng）	8	~80
LungCancer Panel v1.0	~0.23 Mb	1-plex（500 ng）	14	~100
		12-plex（6,000 ng）	11	~70

说明：以上为纳昂达针对gDNA或标准品在16 h杂交时长下的经验循环数及产出。不同实验室因样本类型、实验条件、实验环境不同可能有所差异。

针对文库构建中 Pre-、Post-Capture 扩增引物是否通用？

针对NadPrep®系列产品，在文库构建及靶向捕获时的扩增引物如下：

接头类型	Pre-Capture 扩增引物	Post-Capture 扩增引物	测序平台
NadPrep®UDI Adapter	NadPrep®Amplification Primer Mix	NadPrep®Amplification Primer Mix	Illumina®平台
NadPrep®M-Adapter / BMI Adapter (SI)	NadPrep®M-Index Primer Mix (SI)	M-Amplification Primer Mix (SI)	MGI平台
NadPrep®M-Adapter / BMI Adapter (DI)	NadPrep®M-Index Primer Mix (MDI)	M-Amplification Primer Mix (DI)	MGI平台
NadPrep® Universal Stubby Adapter (UDI)	NadPrep® Universal UDI-Index Primer Mix	Amplification Primer Mix Ⅱ	Illumina®/MGI 平台

NadPrep®通用型文库构建试剂盒（96 rxn）已包含 Pre/Post-Capture 的相关引物。其中 Post-PCR 引物均为 Illumina 或 MGI 平台通用引物，也可使用其它同类型产品替代。

对于捕获后再进行重亚硫酸盐处理的甲基化靶向捕获，该如何处理？

为了解除带有生物素标记的文库与链霉亲和素磁珠的结合，可尝试使用以下二者操作之一（或参考 M270 磁珠官方建议）：

• 溶于 10 mM EDTA、95% 甲酰胺、pH 8.2 的溶液中，混匀并于 65℃下加热 5 min或 90℃下加热 2 min；

• 溶于 0.1 % SDS，混匀并加热煮沸 5 min。

针对不同杂交时长，应该如何进行选择？是否可进一步缩短快速杂交的时长？

尽管杂交捕获体系已经过优化，适用于更短时间的杂交。但与 16 h 杂交相比，不同类型的 Panel 随着杂交时长的缩短，在捕获文库总量、捕获效率、覆盖均一性等方面皆存在不同程度的降低，详见下图。相比中大型 Panel（＞0.4 Mb），小型 Panel（＜0.4 Mb）受到的影响更大。对于有时效性要求的，可对大型 Panel 尝试缩短杂交时间，但不建议将此种情况用于小型 Panel。