全外显子捕获应用

不同平台捕获表现

图 1. Exome Plus Panel v2.0 在MGISEQ-2000 和 Illumina NovaSeq 6000平台的捕获表现。利用 NadPrep^® 系列建库试剂盒进行文库构建，搭配Exome Plus Panel v2.0进行杂交。

不同 gDNA 文库捕获表现

图 2. Exome Plus Panel v2.0 对不同gDNA文库的捕获表现。利用 NadPrep^® 文库构建试剂盒(for MGI)建库，MGISEQ-2000(PE100)测序模式，利用BWA比对到参考基因组 GRCh37/hg19，按照reads数计算。 A. 捕获数据比对率均>99%，捕获效率>92%；B. 捕获数据均可达到 >99% 的区域覆盖>0.2x平均测序深度；C. 覆盖均一性和一致性表现无显著差异； D. 不同GC含量区域覆盖无偏好性。
注：人类男性基因组DNA(Promega-male, G1471)；肿瘤结构变异5% gDNA标准品(菁良，GW-OGTM001)；肿瘤SNV 1-25% gDNA标准品(菁良，GW-OGTM004)；肿瘤SNV 野生型 gDNA 标准品(菁良，GW-OGTM005)。

WES捕获的那些“雷区”

WES 分析中，文库构建和靶向捕获步骤中有不少潜在“雷区”需要注意，躲过这些“雷区”才可能获得稳定可靠的 WES 测序数据。以下是较常见的问题和考虑。

起始样本

样本起始量与质量是靶向测序分析的基石。尤其是对于低频突变的准确检测，足够的原始拷贝数是先决条件。为保证足够的样本文库分子进入全外显子捕获测序分析，我们推荐参考表 1，并根据实际的样本情况来确定起始量。

表1. 全外显子靶向测序样本要求

接头浓度

在接头连接步骤，我们推荐根据 Input DNA 及片段大小确定接头用量。针对外显子捕获的文库构建，推荐 DNA 样本片段化范围为 150 ～ 350 bp。常见接头浓度为 15 μM；当 Input DNA ≥ 500 ng 时，适度增加接头用量可以提高文库产出量；当 Input DNA ≤ 25 ng 时，接头应稀释后使用。

PCR扩增

我们建议根据样本类型、片段化 Input DNA 和文库预期产量调整 PCR 循环数，切忌文库过度扩增。用于 WES 的 DNA 文库，推荐通过循环数控制文库产出至 600 ~ 1,000 ng，随后单个文库取 500 ng 进入杂交体系。外显子捕获测序的重要评价指标之一—重复率（Duplication rate），和扩增数有着直接关系：扩增数越多，因扩增产生的完全一致的文库分子越多，测序数据重复率也相应增加，有效的测序数据量则被削减。

文库的混杂

文库的混杂是指多个样本文库混合进入单次捕获实验。相较于单个文库捕获，混杂后捕获可有效提高生产速度、显著节约成本。混杂比（样本进入杂交反应的文库含量 / 该样本的出库总量）直接影响进入捕获步骤的文库丰度。过低的混杂比引入的测序数据的重复率（Duplication rate）较高，从而降低可用于分析的有效数据量。

此外，进行混合捕获时，若期望多个文库对应的测序数据量一致，则建议每个文库等比混合；若根据不同的检测目的，期望不同的数据量产出，则建议按比例混合进入杂交体系。

封闭非特异序列

在进行人类全外显子捕获时，应根据测序平台和文库类型使用对应的封阻序列（表 2）以及封闭基因组重复序列的 Human Cot-1 DNA。以上组分可以降低接头间和重复序列间的非特异性结合，进而降低脱靶率，提升有效的捕获数据比例。

表2. 不同测序平台推荐的封阻序列

精准控温

在 NGS 杂交洗脱操作中，即使温度发生了轻微改变，也会对外显子捕获的中靶率以及 GC 偏好性产生影响。测序数据中的 GC 偏好将直接影响捕获数据的整体均一性。洗脱温度的偏离，会导致极端 GC 含量区域捕获的偏差或导致非特异性捕获的增加。

捕获后PCR

我们建议依据样本类型、混杂文库总量和杂交时间调整外显子 panel 捕获后的扩增循环数，避免过度扩增。以 Exome Plus Panel 为例，在快速杂交（4h）和过夜杂交（16h）的情况下，推荐常规 gDNA 样本按表 3 选择扩增循环数。

表3. NadPrep^®建库体系推荐的WES捕获后扩增循环数