HRD 分析的整体解决方案
应用背景
HRD 概述
同源重组修复（Homologous recombination repair，HRR）是正常细胞修复 DNA 的重要途径。当 BRCA1/2 基因突变失去功能，会引起同源重组缺陷（Homologous Recombination Deficiency, HRD）。 HRR 通路其它基因，如 PALB2, CDK12，RAD51 等突变，及其他不明原因，都可能引起 HRD。 通常，HRD 导致的可检测的基因现象：“基因组瘢痕”（genomic scars），包括：基因组杂合性缺失（Loss of Heterozygosity, LOH）、大片段迁移（Large-scale state Transition, LST）以及端粒等位基因不平衡（Telomeric Allelic Imbalance, TAI）[1-2]。
HRD 与 PARP 抑制剂
在正常细胞内，同源重组修复机制可让细胞正常修复 DNA 复制错误并存活，而对于已发生 HRD 的肿瘤细胞，同时使用 PARP 抑制剂（PARPi）会导致 DNA 复制叉停滞和 DNA 复制无法顺利进行进而诱导细胞凋亡，实现抗肿瘤的作用。
HRD 检测的临床意义
- 筛选铂类及 PARPi 获益人群，提供用药指导
- 遗传性疾病相关基因检测（遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征、林奇综合征等）
方案推荐
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文库构建 |
封阻序列 |
靶向捕获 |
测序平台 |
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&
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Illumina® Systems |
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MGISEQ / DNBSEQ™ |
捕获表现
图 1. HRR Panel v1.0 的捕获表现。 A. 比对率、中靶率及靶区域覆盖度，B. 靶区域的覆盖均一性和一致性。人类男性基因组 DNA (Promega, G1471) 利用 NadPrep® DNA 通用型文库构建试剂盒 (for Illumina®) 建库， 以 HRR Panel v1.0 进行捕获，NovaSeq 6000，PE150 测序，按照 reads 数计算。
变异分析
图 2. HRR Panel v1.0 应用于标准品的变异分析表现。泛肿瘤 800 gDNA 标准品 (菁良，GW-OGTM800) 利用 NadPrep® DNA 通用型文库构建试剂盒 (for Illumina®) 建库， 以 HRR Panel v1.0 进行杂交捕获，NovaSeq 6000，PE150 测序， Vardict 进行变异分析。
与 HiSNP Ultra Panel 混合捕获表现
图 3. 混合捕获表现。人类男性基因组 DNA (Promega, G1471, Normal)，泛肿瘤 800 gDNA 标准品 (菁良，GW-OGTM800) 和肿瘤 SNV 野生型 gDNA 标准品 (菁良，GW-OGTM005)，分别利用 NadPrep® DNA 通用型文库构建试剂盒 (for Illumina®) 建库， 以 HRR Panel v1.0 和 HiSNP Ultra Panel v1.0 等摩尔浓度混合后进行杂交捕获，NovaSeq 6000，PE150 测序，按照 reads 数计算。A. 比对率和中靶率，B-C. 靶区域的覆盖均一性和一致性表现。
健康 gDNA 标准品
图 4. HiSNP 系列 Panel 分别在 MGI 和 Illumina 平台的捕获表现。 HiSNP (HiSNP Panel v1.0) 和 HiSNP Ultra (HiSNP Ultra Panel v1.0) 在两个测序平台的 A. 比对率和中靶率；B & C. 靶区域的覆盖均一性和一致性表现。
注：样本为人类男性基因组 DNA (Promega, G1471), 分别采用 NadPrep® DNA 通用型文库构建试剂盒 (for MGI) 和 NadPrep® DNA 通用型文库构建试剂盒 (for Illumina®) 建库；MGI 平台采用 MGISEQ-2000，PE 100 测序，Illumina 平台采用 Novaseq 6000, PE 150 测序。
肿瘤 HRD 标准品
图 5. HiSNP Ultra Panel v1.0 在双测序平台对 HRD 标准品的捕获表现。 HiSNP Ultra Panel v1.0 对 HRD 标准品的捕获数据比对率、中靶率、覆盖度均一性和一致性表现。A & B. MGI 平台；C & D. Illumina 平台。
注：样本为菁良肿瘤 HRD 标准品 GW-HRD-3 (GW3)，GW-HRD-9 (GW9) 和 GW-HRD-12 (GW12)，包含 Normal (N) 和 Tumor (T) 细胞系配对样本，分别采用 NadPrep® DNA 通用型文库构建试剂盒 (for MGI) 和 NadPrep® DNA 通用型文库构建试剂盒 (for Illumina®) 建库；MGI 平台采用 MGISEQ-2000，PE 100 测序，Illumina 平台采用 Novaseq 6000, PE 150 测序。
图 6. HiSNP Ultra Panel v1.0 对 HRD 标准品的检测结果。WGS、WES (Exome Plus Panel v2.0) 和 HiSNP Ultra 均可用于 HRD Score 分析， HiSNP Ultra 相较于 WES 更接近于 WGS 和标准品参考值。
注：样本为菁良肿瘤 HRD 标准品，采用 NadPrep® DNA 通用型文库构建试剂盒 (for Illumina®) 建库；采用 Novaseq 6000, PE 150 测序。WGS 测序数据的分析软件为 TITAN v1.17.1，WES 和 HiSNP Ultra 捕获数据的分析软件为 scarHRD v1.0。 WGS、WES 和 HiSNP Ultra 的测序深度分别 ＞ 30x、300x、450x。
肿瘤纯度与 HRD Score
图 7. 肿瘤纯度对 HRD Score 分析的影响。 In silicon 模拟不同纯度的肿瘤样本，使用 scarHRD v1.0 软件分别对肿瘤 HRD 标准品分析 Ploidy、Purity 和 HRD Score。当肿瘤样本纯度＞30-40% 时，HRD Score 值比较稳定且接近于参考值。
注：样本为菁良肿瘤 HRD 标准品 GW3、GW9 和 GW12；采用 NadPrep® DNA 通用型文库构建试剂盒 ( for Illumina®) 建库；测序平台：Novaseq 6000, PE 150。
测序深度与 HRD Score
图 8. 测序深度对 HRD Score 分析的影响。 对测序数据进一步 downsampling 至 250x、200x、150x、100x、50x，使用 scarHRD v1.0 软件分别对肿瘤 HRD 标准品分析 HRD Score、Purity 和 Ploidy。当样本肿瘤含量为 100% 时，测序深度低至 50x 依然可准确分析 HRD Score 值。
注：样本为菁良肿瘤 HRD 标准品 GW3、GW9 和 GW12；采用 NadPrep® DNA 通用型文库构建试剂盒 (for Illumina®) 建库；测序平台：Novaseq 6000, PE 150。
考虑到实际检测样本的肿瘤纯度不可能达到 100%，因此 In silicon 模拟了肿瘤纯度在 30%-40% 之间的样本，以评估测序深度对 HRD Score 分析的影响。
肿瘤纯度、测序深度与 HRD Score
图 9. 肿瘤纯度与测序深度对 HRD Score 分析的影响。In silicon 模拟不同纯度（30%-40%）的肿瘤样本，同时对测序数据 (450x) 进行 downsampling 至 250x、200x、150x、100x、50x，使用 scarHRD v1.0 软件分别对肿瘤 HRD 标准品分析 Ploidy、Purity 和 HRD Score。由于真实样本的肿瘤纯度和倍性不同，故推荐测序深度＞300x，500x 为佳。
注：样本为菁良肿瘤 HRD 标准 品 GW3、GW9 和 GW12；采用 NadPrep® DNA 通用型文库构建试剂盒 (for Illumina®) 建库；测序平台：Novaseq 6000, PE 150。
方案总结
HRD 检测的使用推荐- HiSNP Ultra Panel v1.0 适用于 HRD Score 分析，其表现优于 WES，更接近于 WGS 和标准品参考值
- HRD Score 分析要求样本肿瘤纯度 ＞30%，测序深度 ＞300x
- HRD 临床检测的可行性依赖于多种 Panel 同时使用，具体推荐如下：
图 7. HiSNP Ultra Panel 助力 HRD 检测落地的设计方案。
参考文献
[1] Stewart R A, Pilié P G, Yap T A. Development of PARP and immune-checkpoint inhibitor combinations[J]. Cancer research, 2018, 78(24): 6717-6725.
[2] Watkins J A, Irshad S, Grigoriadis A, et al. Genomic scars as biomarkers of homologous recombination deficiency and drug response in breast and ovarian cancers[J]. Breast Cancer Research, 2014, 16(3): 1-11.
