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解决方案

NadPrep^®️ Hybrid Capture Reagents

货号：

#1005102 #1005101

NadPrep^® Hybrid Capture Reagents 是针对纳昂达科技 Probes 和 Panels 进行靶向捕获杂交洗脱步骤优化的试剂。

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产品表现

图1. NadPrep^® Hybrid Capture Reagents 的表现。采用NadPrep^® DNA Library Preparation Module (for MGI)，搭配 NadPrep^® Universal Adapter (DI) Module 构建 gDNA 文库，NadPrep^® Hybrid Capture Reagents对纳昂达科技不同大小的 panel 捕获测试均表现稳定。

注：样本为 gDNA；测序平台为 MGISEQ-2000，PE100；利用 BWA 比对到参考基因组 GRCh37/hg19，以比对到 Panel 及其侧翼区域上的 reads 数计算中靶率。操作说明采用《DNA 文库杂交捕获（MGI 平台）操作指南》Version 1.5。

本产品仅限研究使用，不用于临床诊断。

杂交捕获试剂

包装编号	管盖颜色	组分名称	包装体积 1005102(16 rxn)	包装体积 1005101 (96 rxn)
Box1		Hyb #1	380 μL	2×1150 µL
		Hyb #2	120 μL	720 µL
		Human Cot DNA	110 μL	650 µL
	/	Bead Wash Buffer	6 mL	35 mL
	/	Wash Buffer 1	5 mL	30 mL
	/	Wash Buffer 2	6.4 mL	38 mL
	/	Wash Buffer 3	3 mL	18 mL
	/	Wash Buffer 4	3 mL	18 mL
Box2	/	Streptavidin Beads	950 μL	5.7 mL

多文库的混合捕获实验，对于文库投入量推荐？

推荐如下：

• 对于 Size 分布均一、所需测序数据量相同的文库，一般在文库混杂投入比＞50 % 的前提下，推荐 500 ng/文库的投入量，以期提高文库丰富度，降低测序数据的重复率；

• 对于 Size 分布不均一、样本质量差异较大、所需测序数据量不同的文库，一般在文库混杂比＞50 % 的前提下，推荐按照摩尔量进行相应比例的混合。

注：1. 混杂投入比=样本进入杂交反应的文库量/样本实际文库构建产出总量*100 %；

2. moles of dsDNA (mol) = mass of dsDNA (g) / ((length of dsDNA (bp) x 617.96 g/mol) + 36.04 g/mol)

杂交捕获前，对于混合文库的浓缩，是否有具体推荐？

目前混合文库的浓缩推荐采用真空浓缩法或磁珠浓缩法，具体操作可参考DNA文库杂交捕获操作指南。相关测试结果表明不同浓缩法的结果基本一致，仅存在轻微GC差异偏好。但真空法更经济、操作简单，而磁珠法则可适配自动化工作站，可根据具体情况进行选择：

浓缩方式	优点	缺点
真空浓缩	操作简便、时间可控、损失低	需要真空浓缩仪
磁珠浓缩	无需另购仪器、可适配自动化工作站	存在DNA损失且需求试剂量增加、存在GC偏好性

Illumina®平台捕获后扩增时，针对不同 Panel 产品是否可提供具体循环数推荐？

捕获终文库得量与许多因素存在相关性，除去实验操作影响外，一般会有以下理论影响因素：样本类型、起始混杂文库总量、Panel 大小、杂交时长、扩增循环数等。为获得良好的实验数据，在满足上机测序所需用量的前提下，应尽量控制捕获后扩增循环数。Illumina®平台在上机测序前会对文库进行指数式扩增的成簇反应，故所需的上机文库总量较低（具体需要根据各测序仪型号以及测序公司要求决定）。对于不同 Panel，可在实验初期参考以下推荐列表，后期再根据具体结果进行调整：

Panel大小	1-plex （500 ng）	4-plex （2,000 ng）	8-plex （4,000 ng）	12-plex （6,000 ng）
＞10 Mb	10 cycles	8 cycles	7 cycles	6 cycles
1 Mb-10 Mb	12 cycles	10 cycles	9 cycles	8 cycles
50 Kb- 1Mb	13 cycles	11 cycles	10 cycles	10 cycles
1 Kb-50 Kb	14 cycles	12 cycles	11 cycles	11 cycles

针对纳昂达商品化 Panel，可参考下表进行选择：

Panel名称	大小	混杂	Post-Capture 扩增循环数	捕获文库产出（ng）
Exome Plus Panel 2.0	~46 Mb	1-plex（500 ng）	8	~70
Exome Plus Panel 2.0	~46 Mb	12-plex（6,000 ng）	6	~200
NanOnco Plus Panel v2.0	~2.6 Mb	1-plex（500 ng）	10	~120
NanOnco Plus Panel v2.0	~2.6 Mb	12-plex（6,000 ng）	7	~80
NanoHema Research Panel v1.0	~1 Mb	1-plex（500 ng）	11	~70
NanoHema Research Panel v1.0	~1 Mb	12-plex（6,000 ng）	7	~80
NanOnCT Panel v1.0	~0.4 Mb	1-plex（500 ng）	12	~80
NanOnCT Panel v1.0	~0.4 Mb	12-plex（6,000 ng）	8	~80
LungCancer Panel v1.0	~0.23 Mb	1-plex（500 ng）	14	~100
LungCancer Panel v1.0	~0.23 Mb	12-plex（6,000 ng）	11	~70

MGI 平台捕获后扩增时，针对不同 Panel 产品是否可提供具体循环数推荐？

捕获终文库得量与许多因素存在相关性，除去实验操作影响外，一般会有以下理论影响因素：样本类型、起始混杂文库总量、Panel大小、杂交时长、扩增循环数等。为获得良好的实验数据，在满足上机测序所需用量的前提下，应尽量控制捕获后扩增循环数。MGI测序平台需要在上机前对文库进行环化，接着再进行滚环式扩增成DNA纳米球（DNA Nanoball）的过程。故所需的上机文库总量高于Illumina® 平台（具体需要根据各测序仪型号以及测序公司要求决定）。根据NadPrep®通用环化试剂盒（for MGI）(货号：1002231）使用说明书V1.0版本描述，环化所需文库推荐投入量至少＞1 pmol，因此我们推荐：

• 对于大型Panel的多样本混杂文库，由于可能所测数据量较多，建议至少需要满足＞1 pmol的总量（＞300 ng）；

• 对于大型Panel的少量样本混杂文库，由于后续会与其他文库混合上机测序，所需文库总量可适当降低。但建议混合送测文库总量＞1 pmol（＞300 ng）；

对于小型Panel的混杂文库，由于后续会与其他文库混合上机测序，所需文库总量可适当降低。但建议混合送测文库总量＞1 pmol（＞300 ng）。

基于上述总量，针对特定类型的Panel，可根据测试结果调整捕获后扩增循环数。针对纳昂达商品化Panel，可参考下表：

Panel名称	大小	混杂	Post-Capture扩增循环数	捕获文库产出（ng）
Exome Plus Panel 2.0	~46 Mb	1-plex（500 ng）	8	~70
		12-plex（6,000 ng）	6	~200
NanOnco Plus Panel v2.0	~2.6 Mb	1-plex（500 ng）	10	~120
		12-plex（6,000 ng）	7	~80
NanoHema Research Panel v1.0	~1 Mb	1-plex（500 ng）	11	~70
		12-plex（6,000 ng）	7	~80
NanOnCT Panel v1.0	~0.4 Mb	1-plex（500 ng）	12	~80
		12-plex（6,000 ng）	8	~80
LungCancer Panel v1.0	~0.23 Mb	1-plex（500 ng）	14	~100
		12-plex（6,000 ng）	11	~70

说明：以上为纳昂达针对gDNA或标准品在16 h杂交时长下的经验循环数及产出。不同实验室因样本类型、实验条件、实验环境不同可能有所差异。

针对文库构建中 Pre-、Post-Capture 扩增引物是否通用？

针对NadPrep®系列产品，在文库构建及靶向捕获时的扩增引物如下：

接头类型	Pre-Capture 扩增引物	Post-Capture 扩增引物	测序平台
NadPrep®UDI Adapter	NadPrep®Amplification Primer Mix	NadPrep®Amplification Primer Mix	Illumina®平台
NadPrep®M-Adapter / BMI Adapter (SI)	NadPrep®M-Index Primer Mix (SI)	M-Amplification Primer Mix (SI)	MGI平台
NadPrep®M-Adapter / BMI Adapter (DI)	NadPrep®M-Index Primer Mix (MDI)	M-Amplification Primer Mix (DI)	MGI平台
NadPrep® Universal Stubby Adapter (UDI)	NadPrep® Universal UDI-Index Primer Mix	Amplification Primer Mix Ⅱ	Illumina®/MGI 平台

NadPrep®通用型文库构建试剂盒（96 rxn）已包含 Pre/Post-Capture 的相关引物。其中 Post-PCR 引物均为 Illumina 或 MGI 平台通用引物，也可使用其它同类型产品替代。

对于捕获后再进行重亚硫酸盐处理的甲基化靶向捕获，该如何处理？

为了解除带有生物素标记的文库与链霉亲和素磁珠的结合，可尝试使用以下二者操作之一（或参考 M270 磁珠官方建议）：

• 溶于 10 mM EDTA、95% 甲酰胺、pH 8.2 的溶液中，混匀并于 65℃下加热 5 min或 90℃下加热 2 min；

• 溶于 0.1 % SDS，混匀并加热煮沸 5 min。

针对不同杂交时长，应该如何进行选择？是否可进一步缩短快速杂交的时长？

尽管杂交捕获体系已经过优化，适用于更短时间的杂交。但与 16 h 杂交相比，不同类型的 Panel 随着杂交时长的缩短，在捕获文库总量、捕获效率、覆盖均一性等方面皆存在不同程度的降低，详见下图。相比中大型 Panel（＞0.4 Mb），小型 Panel（＜0.4 Mb）受到的影响更大。对于有时效性要求的，可对大型 Panel 尝试缩短杂交时间，但不建议将此种情况用于小型 Panel。