NanoRV Panel-Tech Access
NanoRV Panel v1.0-Tech Access 是一款针对人呼吸道病毒设计的靶向捕获 panel，可富集包括冠状病毒、流感病毒、 副流感病毒、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒、肠道病毒、鼻病毒、腺病毒、博卡病毒在内的多种人呼吸道疾病相关病毒序 列。基于最新基因组序列（2020.03）的靶向设计可特别用于 SARS-CoV-2（2019-nCoV）的全基因组捕获。该 panel 包含超过 16,000 条生物素标记的 DNA 探针，适用于多个测序平台的病毒液相杂交捕获。
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NanoRV Panel v1.0-Tech Access 靶向的病毒种属详细参考表1。此 panel 在覆盖病毒参考基因组序列（Refseq）全长的基础上，也参考 “neighbor”（同物种其他基因组序列）或相关数据库序列进行补充设计，可增强对各种已知和未知病毒亚型的富集效果。 全基因组覆盖的病毒序列参考表2。
表1. NanoRV Panel v1.0-Tech Access 靶向病毒种属信息
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科 |
属 |
种 （覆盖） |
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冠状病毒 |
Alpha、beta |
2 alpha、13 beta |
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正黏液病毒 |
A、B、C 型流感病毒 |
A、B、C 型流感病毒 |
|
副粘液病毒 |
Respirovirus、Rubulavirus |
副流感病毒 1、2、3、4 |
|
肺炎病毒 |
2 |
偏肺病毒、呼吸道合胞病毒 |
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微小核糖核酸病毒 |
肠病毒 |
肠病毒 A、B、C、D鼻病毒 A、B、C |
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腺病毒 |
哺乳动物腺病毒 |
人腺病毒 B、C、E |
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细小病毒 |
博卡病毒 |
人博卡病毒 1、2、3、4 |
表2. NanoRV Panel v1.0-Tech Access 全基因组覆盖病毒设计参考基因组
产品表现
图1.NanoRV Panel v1.0-Tech Access捕获效率。 COVID-19 RNA 质控品（菁良，GW-CRPM002）经NadPrep®️ DNA 通用型文库构建试剂盒（for Illumina®️）搭配NadPrep Total RNA-To-DNA Module制备总RNA文库；将靶向7个人类看家基因（HK7）的定制探针spike-in至NanoRV Panel v1.0-Tech Access并进行单次或两次靶向捕获；测序数据以salmon v1.2.0分析，统计各部分reads数占比。SARS-CoV-2与HK7 reads计为中靶部分，rRNA及其它转录本reads计为脱靶部分。
图2. SARS-CoV-2及7个看家基因（HK7）丰度比较。样本为COVID-19 RNA质控品（菁良，GW-CRPM002）；将靶向7个人类看家基因（HK7）的定制探针spike-in至NanoRV Panel v1.0-Tech Access并进行靶向捕获；以salmon v1.2.0软件计算TPM值。
图3. NanoRV Panel v1.0-Tech Access对COVID-19 RNA质控品（菁良，GW-CRPM002）中全长SARS-CoV-2基因组捕获的覆盖均一性。
本产品仅限研究使用，不用于临床诊断。
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货号 |
管盖
颜色 |
产品名称 |
包装
体积 |
包装/储存温度 |
|
1001121 |
|
NanoRV Panel v1.0-Tech Access, 96 rxn |
210 μL |
–20℃ |
推荐如下：
• 对于 Size 分布均一、所需测序数据量相同的文库，一般在文库混杂投入比＞50 % 的前提下，推荐 500 ng/文库的投入量，以期提高文库丰富度，降低测序数据的重复率；
• 对于 Size 分布不均一、样本质量差异较大、所需测序数据量不同的文库，一般在文库混杂比＞50 % 的前提下，推荐按照摩尔量进行相应比例的混合。
注：1. 混杂投入比=样本进入杂交反应的文库量/样本实际文库构建产出总量*100 %；
2. moles of dsDNA (mol) = mass of dsDNA (g) / ((length of dsDNA (bp) x 617.96 g/mol) + 36.04 g/mol)
目前混合文库的浓缩推荐采用真空浓缩法或磁珠浓缩法，具体操作可参考DNA文库杂交捕获操作指南。相关测试结果表明不同浓缩法的结果基本一致，仅存在轻微GC差异偏好。但真空法更经济、操作简单，而磁珠法则可适配自动化工作站，可根据具体情况进行选择：
|
浓缩方式 |
优点 |
缺点 |
|
真空浓缩 |
操作简便、时间可控、损失低 |
需要真空浓缩仪 |
|
磁珠浓缩 |
无需另购仪器、可适配自动化工作站 |
存在DNA损失且需求试剂量增加、存在GC偏好性 |
捕获终文库得量与许多因素存在相关性，除去实验操作影响外，一般会有以下理论影响因素：样本类型、起始混杂文库总量、Panel 大小、杂交时长、扩增循环数等。为获得良好的实验数据，在满足上机测序所需用量的前提下，应尽量控制捕获后扩增循环数。Illumina®平台在上机测序前会对文库进行指数式扩增的成簇反应，故所需的上机文库总量较低（具体需要根据各测序仪型号以及测序公司要求决定）。对于不同 Panel，可在实验初期参考以下推荐列表，后期再根据具体结果进行调整：
|
Panel大小 |
1-plex （500 ng） |
4-plex （2,000 ng） |
8-plex （4,000 ng） |
12-plex （6,000 ng） |
|---|---|---|---|---|
|
＞10 Mb |
10 cycles |
8 cycles |
7 cycles |
6 cycles |
|
1 Mb-10 Mb |
12 cycles |
10 cycles |
9 cycles |
8 cycles |
|
50 Kb- 1Mb |
13 cycles |
11 cycles |
10 cycles |
10 cycles |
|
1 Kb-50 Kb |
14 cycles |
12 cycles |
11 cycles |
11 cycles |
针对纳昂达商品化 Panel，可参考下表进行选择：
|
Panel名称 |
大小 |
混杂 |
Post-Capture 扩增循环数 |
捕获文库产出（ng） |
|---|---|---|---|---|
|
Exome Plus Panel 2.0 |
~46 Mb |
1-plex（500 ng） |
8 |
~70 |
|
12-plex（6,000 ng） |
6 |
~200 |
||
|
NanOnco Plus Panel v2.0 |
~2.6 Mb |
1-plex（500 ng） |
10 |
~120 |
|
12-plex（6,000 ng） |
7 |
~80 |
||
|
NanoHema Research Panel v1.0 |
~1 Mb |
1-plex（500 ng） |
11 |
~70 |
|
12-plex（6,000 ng） |
7 |
~80 |
||
|
NanOnCT Panel v1.0 |
~0.4 Mb |
1-plex（500 ng） |
12 |
~80 |
|
12-plex（6,000 ng） |
8 |
~80 |
||
|
LungCancer Panel v1.0 |
~0.23 Mb |
1-plex（500 ng） |
14 |
~100 |
|
12-plex（6,000 ng） |
11 |
~70 |
捕获终文库得量与许多因素存在相关性，除去实验操作影响外，一般会有以下理论影响因素：样本类型、起始混杂文库总量、Panel大小、杂交时长、扩增循环数等。为获得良好的实验数据，在满足上机测序所需用量的前提下，应尽量控制捕获后扩增循环数。MGI测序平台需要在上机前对文库进行环化，接着再进行滚环式扩增成DNA纳米球（DNA Nanoball）的过程。故所需的上机文库总量高于Illumina® 平台（具体需要根据各测序仪型号以及测序公司要求决定）。根据NadPrep®通用环化试剂盒（for MGI）(货号：1002231）使用说明书V1.0版本描述，环化所需文库推荐投入量至少＞1 pmol，因此我们推荐：
• 对于大型Panel的多样本混杂文库，由于可能所测数据量较多，建议至少需要满足＞1 pmol的总量（＞300 ng）；
• 对于大型Panel的少量样本混杂文库，由于后续会与其他文库混合上机测序，所需文库总量可适当降低。但建议混合送测文库总量＞1 pmol（＞300 ng）；
对于小型Panel的混杂文库，由于后续会与其他文库混合上机测序，所需文库总量可适当降低。但建议混合送测文库总量＞1 pmol（＞300 ng）。
基于上述总量，针对特定类型的Panel，可根据测试结果调整捕获后扩增循环数。针对纳昂达商品化Panel，可参考下表：
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Panel名称 |
大小 |
混杂 |
Post-Capture扩增循环数 |
捕获文库产出（ng） |
|
Exome Plus Panel 2.0 |
~46 Mb |
1-plex（500 ng） |
8 |
~70 |
|
|
|
12-plex（6,000 ng） |
6 |
~200 |
|
NanOnco Plus Panel v2.0 |
~2.6 Mb |
1-plex（500 ng） |
10 |
~120 |
|
|
|
12-plex（6,000 ng） |
7 |
~80 |
|
NanoHema Research Panel v1.0 |
~1 Mb |
1-plex（500 ng） |
11 |
~70 |
|
|
|
12-plex（6,000 ng） |
7 |
~80 |
|
NanOnCT Panel v1.0 |
~0.4 Mb |
1-plex（500 ng） |
12 |
~80 |
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|
|
12-plex（6,000 ng） |
8 |
~80 |
|
LungCancer Panel v1.0 |
~0.23 Mb |
1-plex（500 ng） |
14 |
~100 |
|
|
|
12-plex（6,000 ng） |
11 |
~70 |
说明：以上为纳昂达针对gDNA或标准品在16 h杂交时长下的经验循环数及产出。不同实验室因样本类型、实验条件、实验环境不同可能有所差异。
针对NadPrep®系列产品，在文库构建及靶向捕获时的扩增引物如下：
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接头类型 |
Pre-Capture 扩增引物 |
Post-Capture 扩增引物 |
测序平台 |
|---|---|---|---|
|
NadPrep®UDI Adapter |
NadPrep®Amplification Primer Mix |
NadPrep®Amplification Primer Mix |
Illumina®平台 |
|
NadPrep®M-Adapter / BMI Adapter (SI) |
NadPrep®M-Index Primer Mix (SI) |
M-Amplification Primer Mix (SI) |
MGI平台 |
|
NadPrep®M-Adapter / BMI Adapter (DI) |
NadPrep®M-Index Primer Mix (MDI) |
M-Amplification Primer Mix (DI) |
MGI平台 |
|
NadPrep® Universal Stubby Adapter (UDI) |
NadPrep® Universal UDI-Index Primer Mix |
Amplification Primer Mix Ⅱ |
Illumina®/MGI 平台 |
NadPrep®通用型文库构建试剂盒（96 rxn）已包含 Pre/Post-Capture 的相关引物。其中 Post-PCR 引物均为 Illumina 或 MGI 平台通用引物，也可使用其它同类型产品替代。
为了解除带有生物素标记的文库与链霉亲和素磁珠的结合，可尝试使用以下二者操作之一（或参考 M270 磁珠官方建议）：
• 溶于 10 mM EDTA、95% 甲酰胺、pH 8.2 的溶液中，混匀并于 65℃下加热 5 min或 90℃下加热 2 min；
• 溶于 0.1 % SDS，混匀并加热煮沸 5 min。
尽管杂交捕获体系已经过优化，适用于更短时间的杂交。但与 16 h 杂交相比，不同类型的 Panel 随着杂交时长的缩短，在捕获文库总量、捕获效率、覆盖均一性等方面皆存在不同程度的降低，详见下图。相比中大型 Panel（＞0.4 Mb），小型 Panel（＜0.4 Mb）受到的影响更大。对于有时效性要求的，可对大型 Panel 尝试缩短杂交时间，但不建议将此种情况用于小型 Panel。
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产品 |
货号 |
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NanoRV Panel v1.0-Tech Access, 96 rxn |
1001121 |
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