【指南发布】多款纳昂达Panel评估TMB的效果

TMB（Tumor mutation burden，肿瘤突变负荷）定义为每兆碱基（每1百万个碱基）中体细胞突变的数目（mut/Mb），是一种可量化的临床指标以预测肿瘤对肿瘤免疫治疗的反应。利用二代测序检测 TMB 已经成为临床肿瘤精准治疗的共识。2020年6月16日，FDA 批准帕博利珠单抗治疗组织 TMB≥10个突变/Mb 的既往治疗后疾病进展且没有令人满意替代治疗方案的不可手术或转移性的成人和儿童实体瘤患者，标志着TMB成为又一个泛实体瘤免疫治疗伴随诊断生物标志物。

全外显子目前被认为是评估 TMB 值的金标准。比如，2019年11月美国 FDA 批准的由 NantHealth 的基于全外显子测序的体外诊断平台 Omics Core，用于临床伴随诊断中 TMB 和 468 个基因的体细胞突变检测。另一种常见方法是使用数百个或以上基因组成的靶向 Panel（通常大于1M）计算出的 TMB 值。以下为目前 FDA 获批的 NGS 方法涉及 TMB 计算的汇总：

表1. FDA 获批 NGS 大 panel检测一览

*信息来自 PMID: 32217756

纳昂达提供多款靶向捕获产品用于 TMB 分析，包括 NAD Exome Plus Panel v1.0（下文简称exome+ v1），NAD Exome Plus Panel v2.0（简称exome+ v2）和 NanOnco Plus Panel v2.0（简称Onco+），我们利用标准品（CA0356-0367，菁良，批次号 201908001）和肿瘤配对样本（肿瘤样本经HE染色后确认肿瘤细胞含量>50%）分别对这些 Panel 评估 TMB 的能力进行了评估。

表2.纳昂达Panel覆盖区域

*参考PMID: 32217756，hg19 的 bed 文件，仅计算 CDS 区域

图1. 突变检测分析流程

本文中突变分析流程具体步骤如下：

A. 数据质控

将下机原始数据进⾏ demultiplex 生成每个样本对应的原始 FASTQ 文件。利⽤ FastQC 软件对 FASTQ 文件进⾏质控，检查样本测序质量。参数包括：碱基质量、测序内容、GC 含量、测序读⻓分布等。

B. 数据过滤

对原始 FASTQ 文件进⾏去接头和低质量过滤，生成⾼质量的 FASTQ 文件。利⽤ Trimmomatic 软件去除文库接头、去除质量值低于 3 的碱基和 N 碱基、丢弃⻓度小于 36 的读⻓、丢弃碱基平均质量低于 15 的读⻓等，或根据需求⾃⾏设定过滤阈值。

C. 基因组比对

使⽤ BWA 软件的 MEM 算法，将过滤后的 FASTQ 数据以 PE 方式比对到⼈类参考基因组（hg19）。比对结果存放入 SAM 文件，并进⼀步转换成⼆进制 BAM 文件。

D. 体细胞突变检测前优化

使⽤ GATK 软件对比对结果 BAM 文件进⾏优化，包括 PCR 去重、Read 配对 Fix，BQSR 等步骤，生成优化后的 BAM 文件。

使⽤ GATK 的 mutect2 算法对肿瘤样本和对照样本的配对 BAM 文件进⾏体细胞突变检测。突变检测结果（VCF 文件）包括点突变和插入缺失突。接着对这些突变进⾏过滤，去除低质量突变、⼈⼯引入假阳性突变和胚系突变。

F. 体细胞突变注释

使⽤ Annovar 软件对过滤后的突变 VCF 文件进⾏注释，得到突变临床信息、⼈群频率和功能影响等信息。

值得注意的是，对于 TMB 计算的生信算法，尤其是包含突变的类型，国际和国内的算法不一而足。联系我们（support@njnad.com）获得 NAD-TMB 应用指南，了解更多使用 Panel 评估 TMB 值的注意事项。