DNA 甲基化测序该如何选？EM or BS?

DNA 的甲基化修饰会影响基因的表达，例如转录起始位点附近的低甲基化与较高的转录相关。目前，DNA 甲基化图谱分析在癌症等疾病研究、胚胎发育监测和农业植物研究中被愈加重视。大量研究表明，多种类型癌症中的 DNA 甲基化异常会导致大范围的基因沉默。在癌症早筛早检方面，ctDNA 的甲基化信号比基因突变的信息更加丰富，可进行组织溯源并识别组织分化状态。相比于全基因组甲基化测序，靶向甲基化测序在成本上表现更加优秀^[1]。

DNA 甲基化检测首先要进行甲基转化，一种是重亚硫酸盐法（Bisulfite，BS），将未甲基化的 C 转化为 U。尽管这种方式是最常用和高效的方法，但因其高温强碱的反应条件会导致 DNA 断裂损伤，不适合应用在珍稀样品中，同时也会导致文库比对率和覆盖均一性的降低。另一种方式是利用较为温和的酶转化方式（Enzyme，EM），以减少 DNA 的损伤，但转化效率可能略低^[2]。

纳昂达科技提供甲基化靶向富集解决方案，包括：基于重亚硫酸盐法或酶转化的甲基化测序文库构建试剂盒、针对转化后文库的液相杂交捕获探针设计及合成服务、液相杂交捕获体系及甲基化靶向富集 NGS 自动化分析平台：

样本：甲基化标准品为人甲基化阳性对照 100% Methylated DNA (ZYMO, D5014-2) 和阴性对照 0% Methylated DNA (ZYMO, D5014-1)，经不同比例混合以模拟不同甲基化水平：0%，10%，50% 和 100%，投入量均为 50 ng。真实样本为匿名卵巢癌 FFPE 样本，投入量均为 100 ng。

靶向捕获 Panel：Meth-GC Panel 靶向胃癌相关基因启动子区域及 CpG 位点，共包含 5017 个 CpG 位点，捕获区域约为 60 kb（用于标准品）；Meth-HR Panel 靶向 14 个 HR 通路的基因启动子区域，共包含 507 个 CpG 位点，捕获区域约为 5 kb（用于真实样本）。

其它相关试剂见下表。

表 1. 相关试剂

分析软件：Bismark^[3]、BWA-meth^[4] 和 Msuite^[5] 软件应用于甲基化测序数据的比对，Msuite 和 Bismark 底层均采用 bowtie2 进行比对，而 BWA-meth 则采用 BWA 进行比对。Methlykit^[6]、eDMR^[7] 和DSS^[8] 软件用于真实样本的差异甲基化区域（Differentially Methylated Region，DMR）分析。DSS 软件核心是一个基于贝叶斯层次模型的程序，用于估计 CpG 位点特异性分散，然后进行 Wald-tests 以检测 DMR；eDMR 是基于双峰正态分布模型和成本函数优化进行 DMR 分析；Methlykit 则是采用 Fisher 精确检验或逻辑回归检验来计算 DMR 的显著性。DSS 和 Methlykit 均可以对 DMP 和 DMR 进行分析，而 eDMR 只能对 DMR 进行分析。这三款软件均使用默认参数分析。

表 2. 分析软件列表

纳昂达科技的甲基化文库构建试剂盒支持 BS 和 EM 两种转化方式。EM 转化方式较为温和，文库得量显著高于 BS 转化方式，相应的插入片段也更长一些（图1 A & C）。但是随着投入量的增加，EM 的转化效率会降低（图1 B）。

图 1. 不同转化方式的建库表现。A.文库产出，B. 不同投入量 λ DNA C 碱基转化效率及 C. 插入片段分布。

当使用 BWA-meth 比对时，Meth-GC Panel 靶向捕获的结果显示两种转化方式的中靶率均 > 85%，覆盖均一性上也均有优异的表现，但 BS 转化的有效数据量更低，比对率和中靶率均低于 EM 转化（图2）。

图 2. 标准品靶向甲基化捕获结果

考虑到 BWA-meth 软件本身针对高 GC 区域进行了优化，我们也与两款调用 bowtie2 比对的软件 Bismark 和 Msuite 进行了对比。5017 个 CpG 位点深度的相关性热图显示，BWA-meth 和 Bismark 的相关性很高，均 > 0.7；而 Msuite 跟前两者的相关性很较差（图3），CpG 位点深度偏低，主要原因很可能是 Msuite 软件对读长筛选和质量过滤跟前两者存在较大差异。

图 3. 标准品 CpG 位点不同软件检测覆盖结果

在这些 CpG 位点的甲基化程度散点图的结果中，BWA-meth 跟 Bismark 的 CpG 的甲基化检测结果基本吻合，而 Msuite 的甲基化程度的分布则有很大的区别，在多个位点均出现不一致情况。这很可能也是 Msuite 对甲基化位点基于深度统计的方式导致的，从而影响后续甲基化程度检测的灵敏性。

EM 转化方式中，0% 标准品 CpG 位点出现了不同程度的甲基化，我们进一步的分析显示，主要原因是这些位点为连续 CpG 区域且具有回文结构，由此影响了 EM 转化效率。

图 4. 标准品 CpG 位点不同软件检测甲基化程度结果

两例配对卵巢癌 FFPE 样本 S1 和 S2 使用 Meth-HR Panel 进行靶向甲基化测序分析，EM 转化的中靶率也显著高于 BS 转化（~70% vs ~50%）。不同比对软件分析 CpG 位点的甲基化程度散点图如图 5 所示，BWA-meth 和 Bismark 二者甲基化检测结果较为一致，而 Msuite 的甲基化程度的分布则有很大的区别。

图 5. 真实样本 CpG 位点不同软件检测甲基化程度结果

Bismark 的比对结果兼容性更优，我们先基于此软件的比对结果进行后续 DMR 分析。但结果显示三款 DMR 软件的分析一致性较差：eDMR 未检测到任何 DMR 信息；Methylkit 仅在 S1 样本 BS 转化的 PALB2 基因启动子区有检测到 DMR；DSS 软件则检测到 S1 样本 EM 转化的 BRCA1 启动子区的高甲基化（图6）和 S2-EM/S2-BS 的 HOX9 启动子区的高甲基化（图6）。其中，S1 样本后续经纳昂达 NanOnco Plus Panel v3.0（货号 1001111F）检测为 HR 通路相关基因阴性且被 HiSNP Ultra Panel v1.0 (货号 1001838) 检测判定为高 HRD 样本，这跟预期结果一致：BRCA1 启动子高甲基化导致的基因沉默。

DSS 软件搭配 Bismark 的结果，我们在 BWA-meth 比对结果下进行了重现。但是 S1 样本 BS 转化的结果始终未检测到 BRCA1 基因启动子区的高甲基化，这可能是由于 BS 转化 DNA 的高损害和较低的起始投入量影响了检测灵敏度，导致造成假阴性的结果，还有待于进一步验证。

表 3. 三款 DMR 软件分析结果

图 6. DMR 分析结果

DNA 甲基化维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用。靶向甲基化测序中的重亚硫酸盐法转化对样本损伤较大，使用酶法转化不仅可规避这一问题，应用表现也更优。酶转化法也适用于低起始量样本，从而保留更多有效的表观遗传学信息，尤其适用于肿瘤早筛中珍稀的 cfDNA。

基于纳昂达科技的靶向甲基化测序方案和示例，我们评估了不同的比对和 DMR 分析软件：BWA-meth 软件的比对率更高，对启动子中高 GC 区域有更好的兼容性；DSS 的 DMR 算法针对 BS 和 EM 转化有较高的检测灵敏度。后续我们也将继续抛砖引玉，展示更多甲基化单链建库和双链建库的评测结果，敬请期待！