新品上线 | 基于 μCaler Hybrid System 的 MRD 解决方案

临床通常每个病人收集 > 5 mL 血液，其中总 cfDNA 含量的中位数大约为 7,500 基因组拷贝^[1]。在给定 cfDNA 总量下，基于 NGS 测序的方法同时检测多个位点的突变，能够增加 ctDNA 在液体活检中的检出率，从而达到 MRD 检测要求稳定检出丰度 ≥ 0.02% ctDNA 的标准^[2]。肿瘤知情测序(Tumor-informed sequencing)，先对原发肿瘤组织进行全面的基因组测序获取患者变异图谱，然后定制仅靶向已知一定数量突变位点 Panel 用于 ctDNA 检测分析，可进一步提升检测的灵敏度。但是这种方法耗时长，可能还需要在极短时间里优化 Panel 设计、合成和验证，很难满足临床实践中的短周期要求。

图1. μCaler^® Hybrid System 工作原理

μCaler^® MRD Solution (for Illumina^®) 专为小 Panel 的靶向富集而优化设计，搭载 μCaler^® Hybrid System 以及基于创新型方案设计的 μCaler^® Panel，能够在单日内完成捕获文库构建的全流程。该方案搭配含双端分子标签 (Unique Molecular Identifier, UMI) 的接头建库，可满足 MRD 检测应用对血浆游离 DNA 超低频突变的分析要求。μCaler^® Panel 是基于纳昂达自主知识产权设计推出的商品化或定制化 Panel (μCaler^® Custom Panel)，极速交付周期仅需 3 天。

样本来源：2 名健康捐献者的 gDNA 分别以 99：1、999：1 以及 9999：1 的比例混合得到 Tem A、Tem B、Tem C，人工模拟突变频率为 0.005%-1% 的肿瘤样本。

捕获 Panel：μCaler^® Panel，3 Kb Target region，覆盖 30 个等位基因位点；Traditional Panel：42 Kb Target region (SNP Panel)，覆盖 160 个等位基因位点 (包含上述 30 个位点)。

实验方案：各模拟样本分别取 50 ng 构建含分子标签的文库，然后按 50% 比例一分为二，分别按传统杂交捕获 NadPrep^®️ Hybrid Capture Reagents和 μCaler^® Hybrid System 杂交捕获 (以下简称为 μCaler^® Hyb)  (图2.)。传统杂交捕获 (以下简称为 Traditional Hyb) 因小 Panel 的中靶率偏低，测试时额外增加了区间 (2x 设计) 并杂交 16 小时，以保证捕获性能在最优状态。测序平台为 llumina Novaseq 6000，PE150。

数据分析：按照纳昂达分子标签分析流程，分别使用双链一致性分析 (DCS211) 以及 单链一致性分析 (SSCS ≥ 3) 方法，支持突变的 reads ≥1 即判定为检出。

图2. 低频突变样本模型和实验设计

在模拟样本中，理论突变频率为 1%、0.1% 以及0.01% 的位点数量为 19 个，理论突变频率为 0.5%、0.05% 以及 0.005% 的位点数量为 11 个。当使用分子标签双链一致性分析 (DCS211) 时，μCaler^® Hyb 和Traditional Hyb 的位点平均有效深度在 1,197x-3,593x 之间，均能有效检出全部 19 个 1% 和 11 个 0.5% 的突变位点。但对于 0.1%-0.005% 的突变位点，不同实验组表现出一定的差异，出现了不同程度的漏检 (图3. 深蓝色方框)。

通过模拟计算可知，当平均测序深度为 2,750x 时，不同突变频率下观测到一定数量突变位点的概率。图4. 横向柱形图为 10,000 次随机取样下，各突变频率检出的理论分布预期。不难看出，不论是 μCaler^® Hyb 还是 Traditional Hyb，尽管测序深度不足以检出全部的突变位点，但在极限条件下检测到的平均频数是均符合预期的 (图4. 纵向柱形图)。

理论突变频率为 0.1% 和 0.01% 的位点，μCaler^® Hyb 检测到的突变位点数量平均值分别为 18.3 和 3.7，而 Traditional Hyb 的检出分别为 16.0 和 3.5 (图4. A & C)；理论突变频率为 0.05% 和 0.005% 的位点，μCaler Hyb检测到的突变位点数量平均值分别为 9.3 和2.7，而 Traditional Hyb 检出分别为 8.0 和 2.0 (图4. B & D)。这表明 μCaler^® Hyb 在这些突变频率下的位点检出率均高于 Traditional Hyb。

图3. 0.005%-1% 突变频率下，30 个模拟突变位点的检出分布

图4. 0.005%-0.1% 突变频率下，30 个模拟突变位点的检出统计

注：Observed number of mutation 为 DCS211 分析模式下，不同突变频率检测到的平均突变位点数量；Theoretical number of mutation 为2,750x 时，不同突变频率做 10000 次随机取样，突变检出频数的模拟分布。

当使用分子标签单链一致性分析 (SSCS ≥ 3) 时，可额外检测到 DCS211 分析时判定为阴性的多个位点(图3. 淡蓝色方框)。例如，理论突变频率为0.1%和0.01% 的位点，μCaler^® Hyb 检测到的平均突变位点数量分别为从 DCS211 分析模式下的 18.3 和 3.7，分别上升到 19.0 和 9.3 。尽管在其他突变频率下也可以观察到这一现象，但这类检出结果不能简单判定为阳性。因为此时对照组 (Control) 同样检出了本不应该存在的突变。这些假阳性突变是实验过程、PCR 扩增以及测序等多个环节引入的背景“噪音“，且无法通过 SSCS ≥ 3 的模式去除。故在真实场景下，此分析方法下检出的位点需要综合判别，以取得灵敏度和阳性预测值间的平衡。

基于 NGS 技术检测 MRD，可检测到影像学或血清学等传统技术手段无法监测到的信号。但是漏检或错判会导致患者错过最佳治疗时间或者面对过度治疗的风险，我们在追求灵敏度的同时也要兼顾检测的阳性预测值。μCaler^® MRD Solution 在精简的操作流程下，其性能表现仍然优于传统杂交捕获方案，有助于临床 MRD 检测的快速开展。

参考文献

[1] Van Der Pol Y, Mouliere F. Toward the early detection of cancer by decoding the epigenetic and environmental fingerprints of cell-free DNA[J]. Cancer cell, 2019, 36(4): 350-368.

[2] 《肺癌 MRD 的检测和临床应用共识》.