新品上线 | So easy! 8 分钟一步操作轻松去除 rRNA (上)

浏览量：4284 / 发布时间：2023-09-20

01 背景

RNA 测序 (RNA-Seq) 已经成为生物学基础研究和疾病诊断中的不可或缺的有效工具。它不仅可以检测不同条件下所有基因的表达量的差异，还可以揭示 RNA 结构上的多样性，如：可变剪接、融合基因和基因单点突变等。

在正常细胞/组织的总 RNA 中，核糖体 RNA (rRNA) 通常占比 80% 以上。大量的 rRNA 会占用测序的大部分容量和资源，从而降低了检测目标转录组信息的效率。因此，去除 rRNA 影响是 RNA-Seq 中的关键步骤之一，有助于提高研究的准确性、效率和经济性，特别是针对低丰度转录本的检测，确保测序资源更专注于研究感兴趣的 RNA 分子。

图 1. 哺乳动物细胞内 RNA 的分布占比

02 RNA 富集

RNA-Seq 应用中去除 rRNA 影响的方法可分为正向富集法 (如 Oligo dT 磁珠富集 mRNA) 和反向富集法 (去除 rRNA)。

2.1 Oligo dT 磁珠富集 mRNA

在真核生物中，大多数 mRNA 都具有 ploy (A) 尾的结构特征，因此可以使用 Oligo dT 磁珠富集 mRNA 的方法来获取转录组信息。这种方法价格相对较低，但也存在一些限制：

① 只适用于真核生物，对于不带 ploy (A) 尾的原核生物 RNA 则不适用；

② 只适用于完整性较好的 RNA 样本，因降解造成的 ploy (A) 尾断裂的 mRNA 则无法富集；

③ 仅富集 mRNA，无法富集不带 ploy (A) 尾的 lnc RNA/circRNA 等，大大降低了 RNA-Seq 的多样性；

④ 富集效率依赖于 poly (A) 尾的长度，造成 RNA 建库的偏好性。

2.2 去除 rRNA

基于去除 rRNA 方案又可细分为磁珠法和酶消法。

磁珠法一般通过如下方式实现：特定序列的生物素修饰探针与 rRNA 结合形成杂合链；链霉亲和素磁珠通过与生物素结合，将含有 rRNA 的杂合链吸附在磁珠表面；转移上清等操作去除 rRNA。

酶消法一般通过 RNase H 酶来消化 rRNA：特定序列的 DNA 探针与 rRNA 结合形成杂合链；RNase H 酶将杂合链中的 rRNA 水解成单核苷酸或寡核苷酸；添加 DNase I 来消化 DNA 探针。

以上两种 rRNA 去除方法的适用范围更广泛，对于部分降解的低质量 RNA 样本也可较好地去除 rRNA，但其存在的弊端也显而易见：

① 价格高昂；

② 操作繁琐，移液步骤约 20 步；

③ 耗时长，约 2 hr 去除 rRNA。

RNA富集

图 2. 不同 RNA 富集方法比较

03 rRNA 快速封阻全流程解决方案

纳昂达推出 rRNA 快速封阻全流程解决方案，旨在以更优的成本和简单操作实现 rRNA 的封阻。该方案仅需一步操作中即可快速高效地封阻 rRNA，无需耗费大量时间和精力。核心产品 rRNA 封阻试剂：NadPrep® rRNA Blocking Reagent (Human) 中的高亲和力寡核苷酸与人源 rRNA 结合后，可阻止其反转录，从而极大减少 rRNA 在测序文库中的占比。

3.1 方案原理及流程

在总 RNA 反转录前，rRNA Blocking Reagent (Human) 优先与 rRNA 结合，且不影响随机引物和 Oligo dT 与 RNA 的结合。在反转录过程中，rRNA Blocking Reagent 可阻止 rRNA 的反转录，而非 rRNA 则可顺利进行，从而达到封阻的效果。

原理图-2-02

图 3. rRNA Blocking Reagent (Human) 封阻原理

全流程

图 4. rRNA 快速封阻全流程解决方案 (双链 DNA 的合成)

3.2 方案特色

rRNA 快速封阻全流程解决方案采用 NadPrep® rRNA Blocking Reagent (Human) 搭配 NadPrep® Total RNA- To-DNA Module，衔接 NadPrep® DNA 通用型系列文库构建试剂盒，可实现总 RNA 中 rRNA 的快速封阻。该封阻试剂使用简单，仅需一步移液操作将 rRNA Blocking Reagent (Human) 加到反应体系中，并在随后的高温片段化后经过 8 min 的梯度降温反应，即可快速封阻总 RNA 中的 rRNA。

① 操作快速便捷；

② 兼容不同质量的 RNA 样本；

③ rRNA 封阻仅需 8 min，双链 DNA 合成全流程耗时 2.5 hr；

④ 有效富集低丰度 RNA，降低测序成本；

⑤ 适配第三方 RNA 文库构建试剂盒。

3.3 方案表现兼容多类型样本的 rRNA 封阻

将 rRNA 快速封阻全流程解决方案运用于完整度较高的细胞系 RNA 样本，A 级以及 B 级 FFPE 来源的 RNA 样本，投入量从 50 ng 到 500 ng 不等。结果均显示，针对同一样本类型，总 RNA 中的 rRNA 封阻效果在不同的投入量下保持同一水平，且 rRNA 的封阻对 RNA 反转录效果及转录本覆盖均一性并不会造成影响。