我宣布！这就是拯救低质量和微量样本的神之一手！双平台任你选！
01背景
文库制备是所有 NGS 湿实验的基石，其质量高低对测序有着至关重要的影响。然而，由于低投入量、低质量或严重降解样本的存在，会导致接头连接效率的极大降低，如何提高此类样本的文库制备成功率，仍是亟待解决的重要问题。
此前，纳昂达已推出适用于 Illumina 平台的 ssDNA 通用型文库制备方案 (双低样本的成功建库是如何炼成的？单链建库技术助力成功率 up up up!) (甲基化文库构建黄金搭档——单链建库技术)，旨在解决双低样本的建库难题。该方案可利用单链 DNA 作为模板进行文库构建，有效提升了低投入量及低质量样本的建库效率，同时基于优化的连接设计，为用户提供了更高精度的单链甲基化文库制备解决方案。
近日，通过独特的接头优化设计，纳昂达现推出了适用于 MGI 平台的 ssDNA 通用型文库制备方案，其能实现与 Illumina 平台相媲美的建库及杂交捕获性能，助力低投入量/微量、低质量及亚硫酸氢盐转化样本高效建库。此外，MGI 平台还能实现更低的文库重复率和更高的数据利用率，从而为用户提供更多选择，满足多样化应用需求，提升多领域应用能力。
02方案简介
ssDNA 通用型文库制备方案基于高效的单链连接原理，特别适用于低投入量、低质量或严重降解样本的文库构建，起始量可从 10 pg 到 250 ng，适用于全基因组测序、全基因组甲基化测序，同时兼容液相杂交靶向捕获测序。经过优化设计，该方案可兼容 cfDNA、gDNA、FFPE DNA，及其亚硫酸氢盐转化后的产物。
图 1. NadPrep® ssDNA 通用型文库制备方案流程示意图。
注：示意图以搭配 NadPrep® Universal Adapter (MDI)
Module (for ssDNA) 为例。
03方案特色
04方案表现
前期，我们已详细介绍了 ssDNA 通用型文库制备方案应用于 Illumina 平台的表现，该方案充分展现了单链建库技术在低质量、低投入量样本和甲基化建库方面的巨大潜力，其高效的转化能力能够更好地处理受损、降解或微量的 DNA 样本，为癌症早期诊断和个性化诊疗提供了新的可能性。这一期，小编将带你深入了解 ssDNA 通用型文库制备方案在 MGI 平台上的具体表现！
4.1宽泛的样本投入量范围
ssDNA 通用型文库制备方案 (for MGI) 支持投入量 10 pg-250 ng 的稳定建库。使用人类基因组 DNA 标准品 (Promega，G1521)
(图 2. A) 及其亚硫酸氢盐转化产物 (图 2. B) 在不同投入量下 (10 pg-250 ng) 分别进行测试，参照推荐 PCR 循环数进行扩增，两种类型的样本在各投入量下均能得到较为理想的文库产出。
图 2. ssDNA 通用型文库制备方案 (for MGI) 对不同类型样本在不同起始量下的文库产出。A. gDNA 样本文库产出；B. gDNA 亚硫酸氢盐转化产物文库产出。利用 NadPrep® ssDNA
Library Preparation Module 搭配 NadPrep® Universal
Adapter (MDI) Module (for ssDNA) 对 gDNA 样本及其亚硫酸氢盐转化产物进行预文库构建，亚硫酸氢盐转化试剂为 NadPrep® DNA Methyl Bisulfite Conversion Module。
4.2全面提升双低样本靶区域覆盖度和平均测序深度
将 ssDNA 通用型文库制备方案与同方法学进行对比测试，结果显示，无论是常规建库 (图 3. A & B)，还是甲基化建库 (图 3. C & D)，纳昂达方案都能够实现更高的有效测序深度，从而为检测样本提供更准确的结果和更全面的信息。
图 3. NadPrep® ssDNA 通用型文库制备方案与同方法学单链建库试剂盒建库性能比较。A & C. 靶区域覆盖度； B & D.平均测序深度 (去重后)。A-B 为 FFPE DNA 常规建库：不同等级 FFPE 样本分别利用 ssDNA 通用型文库制备方案 (for Illumina®) 和 Vendor A* 的同方法学建库试剂盒进行预文库构建，以 NadPrep® Hybrid Capture Reagents 和 LungCancer Panel v1.0 进行杂交捕获。C-D 为 gDNA 与 cfDNA 甲基化建库：不同类型的样本经 EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Zymo) 进行亚硫酸氢盐转化后，分别利用 ssDNA 通用型文库制备方案 (for Illumina®) 和 Vendor I* 的同方法学建库试剂盒进行预文库构建。以 NadPrep® Hybrid Capture Reagents 和甲基化 Demo Panel (60 Kb) 完成杂交捕获。测序模式为 Illumina Novaseq 6000 PE 150。
注：FFPE DNA 分级标准 |
FFPE_B，~15 kb 有隐约可见主带，同时存在中度弥散；FFPE_C，在 200-2500 bp 之间存在弥散状分布，无清晰主带；FFPE_D，主要分布在 250-1000 bp，呈弥散状。
4.3兼容多元类型样本
ssDNA 通用型文库制备方案 (for MGI) 支持 gDNA、FFPE DNA、cfDNA 及其亚硫酸氢盐转化产物等多种类型样本进行文库构建。不同类型样本在推荐循环数条件下均能得到较为理想的文库产出 (图 4. A)，且文库片段分布较为集中，未观察到明显的接头二聚体产生 (图 4. B)。
图 4. ssDNA 通用型文库制备方案 (for MGI) 对不同类型样本的建库性能表现。 A.不同类型样本文库产出；B. 不同类型样本文库片段分布。
4.4双平台均可实现微量样本高效捕获
低起始量/微量样本的建库是 ssDNA 文库制备方案的重要应用场景之一，通过单链建库能够更好利用微量模板这一特性，可实现建库成功率的有效提升，取得更高质量的测序数据。微量 gDNA 样本 (0.1 ng、1
ng、5 ng 和 10 ng) 利用双平台 ssDNA 通用型文库制备方案分别进行预文库构建。结果显示，由于接头序列的不同，在相同投入量和扩增循环数下，MGI 平台的文库产出略低于 Illumina 平台 (图 5. A)，但衔接 NadPrep® Hybrid Capture Reagents 搭配 LungCancer Panel
v1.0 进行杂交捕获后，二者在比对率、中靶率和靶区域覆盖度等性能指标方面均无明显差异 (图 5. B & C)。同时，由于 MGI 平台独特的 DNB 制备技术，使得 ssDNA 通用型文库制备方案应用于 MGI 平台的去重后有效深度更高 (图 5. D)。
图 5. 低起始量样本双平台 ssDNA 通用型文库制备方案建库及杂交捕获性能表现。A. 文库产出； B. 比对率 & 中靶率；C. 靶区域覆盖度； D.平均测序深度 (去重后)。
4.5双平台均可对低质量样本实现极致数据利用率
单链建库方案同样可以提升低质量样本的建库效率及测序数据质量。利用双平台 ssDNA 通用型文库制备方案对不同质量的 FFPE DNA 样本分别进行预文库构建，衔接 NadPrep® Hybrid
Capture Reagents 搭配 LungCancer Panel v1.0 进行杂交捕获，双平台文库制备方案在比对率、中靶率和靶区域覆盖度等方面均有优异且一致的性能表现 (图 6. A & B)。ssDNA 通用型文库制备方案应用于 MGI 平台对低质量 FFPE 样本同样能够获得更高的去重后有效深度 (图 6. C)。
图 6. 低质量 FFPE DNA 样本双平台 ssDNA 通用型文库制备方案建库及杂交捕获性能表现。A. 比对率 & 中靶率； B. 靶区域覆盖度； C. 平均测序深度 (去重后)。
4.6双平台均可实现甲基化水平更高精度定量
将人甲基化阳性对照 (Methylated DNA, Zymo, D5014-2) 与阴性对照 (Non-Methylated DNA, Zymo, D5014-1) 按不同比例混合，以模拟不同甲基化水平 (0、10%、50%、100%) 的样本。经 NadPrep® DNA Methyl Bisulfite
Conversion Module 进行亚硫酸氢盐转化后，利用双平台 ssDNA 通用型文库制备方案分别进行预文库构建，衔接 NadPrep® Hybrid Capture Reagents 搭配甲基化 Demo
Panel (60 Kb) 进行杂交捕获。结果显示，对于不同甲基化水平的模拟样本，双平台 ssDNA 通用型文库制备方案所构建的捕获文库均可准确反映样本甲基化水平 (图 7.)。
图 7. ssDNA 通用型文库制备方案对不同甲基化水平模拟样本的双测序平台靶向测序表现。A. 不同甲基化水平的实际检测结果；B. 靶区域 CpG 甲基化水平。
4.7双平台均可实现更高置信度突变检出
肿瘤结构变异 5% gDNA 标准品 (菁良，GW-OGTM001) 利用双平台 ssDNA 通用型文库制备方案分别进行预文库构建，衔接 NadPrep® Hybrid Capture Reagents 搭配 LungCancer Panel v1.0 进行杂交捕获，根据不同测序平台对结构变异、融合位点检测 reads 及总 reads 的结果计算突变频率。结果显示，双平台均能得到与标准品标称突变频率高度一致的检测值 (表 1. & 图 8.)。
表 1. 标准品变异一致性分析
图 8. NadPrep® ssDNA 通用型文库制备方案在不同测序平台对标准品的变异一致性分析。
05应用展望
面对低质量与微量样本处理的艰巨挑战，ssDNA 通用型文库制备方案凭借其对单链模板极高的连接效率，为研究者提供了一套稳定且性能卓越的建库解决方案。该方案显著提升了双低样本的建库成功率，尤其在处理极低质量的 FFPE 样本时表现更为出色。同时，该方案可应用于高精度的甲基化定量检测场景。这套“天选”方案，无疑为基因组学研究的深入探索及临床诊断的精准实施，提供了前所未有的坚实支持与强大动力！
