酶切建库：低质样本兼容与超低背景噪音，"鱼" 与 "熊掌" 何以兼得？
01 背景
DNA 片段化是 NGS 文库制备过程中的关键环节，主要方法包括超声破碎法和酶切法。超声破碎法依赖于专业设备，需根据样本特性反复优化参数，操作复杂且易造成微量样本的大量损耗，应用范围受限。相比之下，酶切法采用片段化酶随机打断 DNA，具有显著优势：
· 无需额外设备，更易集成至 NGS 自动化工作站；
· 对样本损伤小，尤其适用于微量或珍稀样本；
· 片段分布均匀，仅需调整酶切时间即可灵活控制 DNA 片段大小；
· 操作流程简便高效，满足病原检测等高时效性场景的应用需求。
近年来，随着 NGS 在不同终端应用场景中的快速深入，用户对文库片段化均一性、工作流程效率、极限投入量范围以及低质量样本背景噪音控制等方面的需求愈发突出。基于对现有 NGS 流程痛点的深刻洞察，纳昂达即将推出全新升级的 NadPrep® 快速 DNA 酶切文库构建试剂盒 v3，以期为科学研究与临床应用提供更高性能、更强兼容性的解决方案。
02 产品简介
NadPrep® 快速 DNA 酶切文库构建试剂盒 v3 是基于 A-T 连接原理开发的双链 DNA 文库构建试剂盒，适用于主流高通量测序平台。该试剂盒通过优化酶切体系，在提升文库产量的同时保持低背景噪音，并显著提升文库丰富度。该试剂盒适用于多种类型样本，包括 gDNA 和不同等级的 FFPE DNA，尤其对极低质量 FFPE 样本的建库流程进行了优化。该试剂盒操作流程简单，在单个步骤内即可完成对样本的片段化、末端修复和加 A，适用于投入 5-500 ng DNA 的全基因组测序，同时兼容液相杂交靶向捕获测序。
产品特色
· 多类型样本兼容性强，轻松应对 gDNA 与不同等级的 FFPE DNA (B+/B/C/D)；
· 片段化、末端修复和加 A 一步完成，简化流程，操作更便捷，提升实验效率；
· DNA 片段化长度灵活精准可控，有效提高酶切片段回收率与文库丰富度；
· 极低质量样本下依然保持低背景噪音，减少假阳性干扰，增强变异检测的可靠度；
· 反应体系灵活，自动化适配性强，无缝集成至 NGS 自动化工作站，释放人力资源。
03 性能表现
3.1 文库产出稳定提升
NadPrep® 快速 DNA 酶切文库构建试剂盒 v3 具有较宽的样本起始量投入范围，支持 5-500 ng DNA 的文库制备。为了评估其性能，我们以人类基因组 DNA 标准品 (Promega, G1521) 为模板，在不同起始投入量条件下，分别采用 NadPrep® 快速 DNA 酶切文库构建试剂盒 v3 (NadPrep Enfrag v3) 和 v2 (NadPrep Enfrag v2) 构建全基因组测序 (WGS) 文库。结果显示，v3 在所有测试起始投入量下均能稳定达到预期文库产量，且在相同实验条件下，v3 的文库产量较 v2 具有显著提升 (图 1.)。
图 1. NadPrep® 快速 DNA 酶切文库构建试剂盒 v3 及 v2 对不同起始投入量 gDNA 样本的建库产出。NadPrep Enfrag v3 和 NadPrep Enfrag v2 分别搭配 A. NadPrep® Universal Stubby Adapter (UDI) Module (以下简称为 UDI) 和 B. NadPrep® Universal Adapter (MDI) Module (for MGI) (以下简称为 MDI) 构建文库，酶切 20 min，扩增循环数参考相应说明书。
3.2 多类型样本灵活兼容
NadPrep® 快速 DNA 酶切文库构建试剂盒 v3 具有广泛的样本兼容性，可高效支持不同质量样本的文库构建。与 v2 相比，v3 在 gDNA 等常规样本及 FFPE DNA 等低质量样本的建库过程中均表现出更高的文库产出 (图 2.)。
图 2. NadPrep® 快速 DNA 酶切文库构建试剂盒 v3 及 v2 对不同类型样本的建库产出。A. UDI；B. MDI。
注：gDNA 样本为人类基因组 DNA 标准品 (Promega, G1471)；样本分级标准 | gDNA：~ 15 Kb 有明亮单一不拖尾条带；FFPE B：~ 15 Kb 有隐约可见主带，同时存在中度弥散；FFPE C：条带主要分布在 200-2500 bp，呈弥散状；FFPE D：条带主要分布在 250-1000 bp，呈弥散状。
3.3 保持低水平背景噪音
在酶切片段化环节中，部分反向重复序列易形成颈环结构，进而在末端修复和 PCR 扩增过程中产生重复的 Artifact 序列，而即使少量的 Artifact 也会对突变分析造成显著干扰。通过工艺优化，NadPrep® 快速 DNA 酶切文库构建试剂盒 v3 在相同质量样本条件下，不仅显著提高了文库产量，还有效降低了 Artifact 序列的产生率。结果显示，与 Vendor A* 相比，NadPrep® 系列 DNA 酶切文库构建试剂盒 (v3 & v2) 始终保持更低的背景噪音，且在极低质量的 FFPE D 级样本中这一优势更为明显 (图 3.)，为高精度变异检测分析提供了可靠保障。
图 3. 不同类型样本经不同酶切文库构建试剂盒建库时文库产出中异常 reads 的占比。不同类型样本分别使用 NadPrep® 快速 DNA 酶切文库构建试剂盒 v3、v2 和 Vendor A* 进行预文库构建，500 ng/预文库投入杂交，以 NanOnco Plus Panel v3.0 和 NadPrep® Hybrid Capture Reagents 完成捕获，按照 total reads 计算。A. UDI；B. MDI。
注：Artifact rate: 酶切副产物引入的异常序列占比。gDNA 和不同等级的 FFPE 样本的起始投入量分别为 50 ng 和 100 ng。
3.4 文库丰富度显著提升
为了评估文库的丰富度，我们使用 50 ng 泛肿瘤 800 gDNA 标准品 (GeneWell，GW-OGTM800) 构建了预文库，并基于一致性序列的覆盖深度，比较了 NadPrep® 系列 DNA 酶切文库构建试剂盒 (v3 & v2) 和 Vendor A* & B* 的性能表现。结果显示，v3 在双链一致性序列 (Duplex Consensus Sequences, DCS211) 覆盖深度上明显优于 v2 及 Vendor A* 和 B* (图 4.)。
图 4. NadPrep® 快速 DNA 酶切文库构建模块 v3 较 v2 显著提升文库丰富度。分别使用 NadPrep® 快速 DNA 酶切文库构建试剂盒 v3、v2、Vendor A* 和 Vendor B* 构建预文库，500 ng/预文库投入杂交，以 μCaler® Full Screen LF Custom Panel (针对 GW-OGTM800 标准品所包含的 15 个突变设计的定制探针) 和 μCaler® Hybrid Capture Reagents v2 完成捕获。每个样本随机选取 2 M reads pair 去重后用于数据分析，以双链一致性序列 (DCS211)、单链一致性序列 (SSCS) 为标准进行过滤。
3.5 标准品变异一致性
为了评估 NadPrep® 快速 DNA 酶切文库构建试剂盒 v3 在捕获文库中对各类变异的检出能力及频率一致性，我们采用泛肿瘤 800 gDNA 标准品 (GeneWell，GW-OGTM800) 经不同酶切文库构建试剂盒构建预文库，以 μCaler® Full Screen LF Custom Panel 和 μCaler® Hybrid Capture Reagents v2 完成捕获。结果显示，除 Vendor B* 对标准品中所包含的 2 个融合变异未能检出外，不同酶切文库构建试剂盒均可有效检测点突变、插入、缺失及融合等多种类型变异，且所检测的变异频率与标准品标称突变频率基本一致 (表 1.)。
表 1. 经不同酶切文库构建试剂盒构建文库的捕获数据中变异频率与标准品标称频率的一致性展示。
3.6 靶向捕获性能优异稳定
分别将 NadPrep® 系列 DNA 酶切文库构建试剂盒 (v3 & v2) 和 Vendor A* & B* 应用于靶向捕获文库的构建，以评估其系统性能。结果显示，v3 在捕获数据的比对率、中靶率、覆盖均一性、Fold 80 等关键指标上延续了 v2 的优异表现，并与 Vendor A* & B* 的表现基本相当 (图 5. A-C)。更值得关注的是，v3 在数据准确性方面实现了进一步提升——其捕获文库中嵌合体比例明显低于其他试剂盒 (图 5. D)，从而提供了更高的数据可信度。
图 5. NadPrep® 快速 DNA 酶切文库构建试剂盒 v3 构建文库的捕获表现。50 ng gDNA 样本分别使用不同酶切建库试剂盒构建预文库，500 ng/预文库投入杂交，以 NanOnco Plus Panel v3.0 和 NadPrep® Hybrid Capture Reagents 完成捕获，测序模式为 NovaSeq 6000，PE150，每个样本随机选取 2 M reads pair 用于数据分析，按照 total reads 计算。A. 比对率 & 中靶率；B. 靶区域覆盖度；C. Fold 80；D. 嵌合体比例 (嵌合体 reads 数/reads 总数)。
04 应用展望
随着 NGS 技术的快速发展，酶切 DNA 文库制备凭借其操作简便、兼容性强和高均一性等优势，正展现出更加广阔的应用前景，为基因组学研究和临床检测提供了更多应用可能性。纳昂达文库构建和杂交捕获系列产品将持续致力于技术创新，不断优化性能，为科研和临床工作者提供更高效、更可靠、更优质、更广泛的 NGS 解决方案。
