既得“东风”，合璧焕宸纬 | 纳昂达自动化解决方案（for MGI）
基因检测被大规模应用于肿瘤的早筛、早诊、愈后实时监测等精准医疗领域，为临床医生对病例的分析分型、病程检测、用药指导等提供了可依之据。由众多专家和专业机构协作连年更新、完善的各类临床检测应用专家共识的出台和标准制定，也彰显出国家对 NGS 检测应用方面的重视与支持。特别是 2021 年 6 月开始实施的《医疗器械监督管理条例》（739 号令），第五十三条明示体外诊断试剂可以以“LDT身份”在医疗机构先试先行，加快了 NGS 临床检测实验室蓬勃发展。那么，如何实现量的飞跃，同时又能保证检测质量呢？自动化则是其中重要一环。
随着国产医疗器械的不断进步，相关医疗仪器设备、试剂百花齐放。华大智造 MGISP-100、960 是两款优秀的国产自动化样本制备仪，其主要配置及性能介绍见图1[1]。而为了更高效的将基因检测运用于自动化平台，纳昂达相继开发了结合自身产品特性的自动化适配整体解决方案，以便于帮助客户将检测快速延伸至自动化工作站，优化布局实验空间、消除操作员间差异性和随机错误、高效控制全流程实验运转周期。
图1. MGISP-100/960产品简介（信息整理自华大智造官网https://www.mgi-tech.com/）
方案介绍
NadPrep️® 快速 DNA 酶切文库构建试剂盒由于优秀的酶切时长、片段控制，更适合于自动化操作；其次我们针对酶切引入背景噪音问题也进行深度优化[2]（详见《酶切片段化建库，奇怪的知识增加了！》）。近期为进一步过滤酶切引入 Artifact reads，纳昂达专门开发的噪音过滤软件（已申请软著），已免费开放使用。故基于我们此建库和配套捕获方案进行了与 MGISP-100、960 的深度整合。经过脚本编译、优化和多轮的测试和验证，现已实现除试剂摆放外的一键式操作（表1）（图2）。以下为详细的测试介绍：
表 1.自动化靶向捕获全套试剂
图 2. 自动化运行流程
注：以 96 samples/run 的文库构建为例，可减少~6 h 的人工参与；对于 MGISP-100 自动化样本制备系统推荐 1-16 samples/run，MGISP-960 推荐 1-96 samples/run。
自动化运行表现
// 稳定的文库产出
相同实验参数下，MGISP-100/960自动化文库构建的产量皆＞1000 ng。尽管当样本数量不同时产出略有差异，但不同批次的自动化方式建库产量相对稳定，而手动操作则因不同人员影响，产出相差较大（图3）。值得注意的是，无论手动操作还是自动化操作，文库片段分布均符合预设标准（30 min，~250 bp Insert DNA Size），各批次间保持一致（图4）。
图 3. NadPrep®️ 快速 DNA 酶切文库构建试剂盒 (for MGI) 在 Manual/MGISP-100/960 建库产出稳定。
实验参数：50 ng Human Genomic DNA（Promega，G1521），30 min酶切时长，搭配 NadPrep®️ Universal Adapter（SI）Module ，单筛，5 cycles。
图 4. NadPrep®️ 快速 DNA 酶切文库构建试剂盒 (for MGI) 在Manual/MGISP-100/960 片段分布大小基本一致。
30 min 酶切条件下，A. 文库片段分布（Agilent 2100 Bioanalyzer）; B. 测序分析真实 Mean Insert DNA Size~250 bp。MGISEQ2000，PE100 测序模式。
// 不同批次试剂，无差异
为评估酶切建库试剂盒之间可能的批次差异，我们随机选取了两个批次的建库试剂盒，分别在相同实验参数下，进行自动化文库构建。无论是文库产量还是片段分布，批次间均无显著差异（图5）。这也得益于酶切时长较竞品更容易控制的原因。而市场上某些酶切建库试剂盒，由于酶切时长较短或酶切效率的原因，不同批次间可能难以达到相一致的产出。
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图 5. 不同批次试剂盒自动化建库产出稳定。
实验参数：50 ng Human Genomic DNA（Promega，G1521），30 min酶切时长，搭配 NadPrep®️ Universal Adapter（SI）Module ，单筛，5 cycles。自动化平台：MGISP-960。
// 高度一致的捕获表现
对不同方式构建的文库，使用泛实体瘤 NanOnco Plus Panel v2.0（~2.6 Mb）进行靶向捕获，并分别评估自动化捕获文库在碱基质量、比对率、中靶率、自连率、酶切引入背景噪音比例、覆盖均一性等指标。结果显示，自动化靶向捕获文库与手动操作表现高度一致，可同样达到比对率＞99.8 %、中靶率~90 %、0.2× Mean >99 % 等优秀指标（图6）。
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图 6. Manual/MGISP-100/960 构建文库测序表现。
A. 文库碱基质量；B. 比对率；C.中靶率；D. 自连率；E. Artifact rate；F. ＞0.2×Mean；G. ＞0.5×Mean；H. 不同建库平台 GC 含量区域覆盖无偏好性。实验&测序分析参数：30 % 混杂比/杂交文库，以 NanOnco Plus Panel v2.0 搭配NadPrep®️ Hybrid Capture Reagents 完成杂交捕获，8 cycles。MGISEQ2000，PE100 测序模式，下机数据统一截取 2 M read pair 分析。
// 突变检出一致性
通过 SNP 位点检出分析，我们模拟检测不同方式的捕获文库在突变检出方面的差异。结果显示，多批次自动化捕获建库间、不同平台间、以及与超声片段化文库间，SNP 检出一致相关系数皆达到 0.97 以上，检出一致性高（图7）。
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图 7. Manual/MGISP-100/960 构建文库 SNP 位点检出一致性佳。
A. MGISP-100 两批次文库构建 SNP 位点检出一致性比较；B. MGISP-960 两批次文库构建 SNP 位点检出一致性比较；C. MGISP-100/960 分别文库构建 SNP 位点检出一致性比较；D. MGISP-100/960 文库构建与手工文库 SNP 位点检出一致性比较；E. 手工、MGISP-100/960 酶切文库构建与超声文库 SNP 位点检出一致性比较。
// 兼容复杂样本来源
酶切片段化效果与样本类型和孵育时长均密切相关。针对不同质量多种类型 DNA 样本，不少竞品推荐分级处理，使用不同的实验参数进行酶切片段化。但这一做法显然并不适用于高通量的自动化文库构建文库。相较而言，纳昂达的酶切方案支持较为宽泛酶切时长同时，也适用于不同质量等级的样本，可得到相对更为均一的产出和一致的文库片段分布（图8）。
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图 8. 不同样本类型自动化建库产出。实验参数：50 ng DNA，30 min 酶切时长，搭配NadPrep®️ Universal Adapter（SI）Module ，单筛，5 cycles。自动化平台：MGISP-100。
正是基于纳昂达靶向捕获自动化整体解决方案的卓越表现，纳昂达有幸作为肿瘤大 Panel 自动化建库方案的唯一指定试剂供应商，全程参与了 2021 年全国第二届自动化建库大赛“这！就是建库”。目前上海和武汉赛场的实操部分已全部结束，让我们共同期待比赛结果的最终出炉。
关于纳昂达科技
纳昂达科技秉承“ Nano Trans More ”的核心理念和“靶向精准，用心服务诊断”的奋斗宗旨，致力于为科研院校、医疗机构、临检单位、产业公司、测序服务商等提供专业化和高质量的靶向测序产品与闭环解决方案。在今后的研究实践中，纳昂达依旧会聚焦靶向测序整体解决方案的开发，同领域专家及行业同仁一道推进肿瘤分子诊断技术不断进步。
Nanodigmbio
微信公众号 | nanodigmbiotech
[1] https://www.mgi-tech.com/
[2] Gregory T, Ngankeu A, Orwick S, et al. Characterization and mitigation of fragmentation enzyme-induced dual stranded artifacts[J]. NAR genomics and bioinformatics, 2020, 2(4): lqaa070.
