把握以下3个关键因素，让你稳定检出MSI

微卫星位点（microsatellite，MS）一般指由 1～6 个核苷酸串联成簇的重复序列，广泛分布于基因组中。微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI）指与正常组织相比，微卫星位点由于 DNA 错配修复基因的功能缺陷（deficient mismatch repair，dMMR）导致复制错误不断积累，使得重复长度发生改变的现象。MSI 根据程度被分为三类：微卫星高度不稳定性（MSI-hgih，MSI-H）、微卫星低度不稳定性（MSI-low，MSI-L）、微卫星稳定（microsatellite stability，MSS）。

MSI 和 dMMR 是肿瘤免疫治疗的重要标志物。KEYNOTE-016 研究提示，dMMR/MSI-H 可以有效预测晚期实体瘤患者是否从免疫检查点抑制剂治疗中受益，且与具体癌种无关。其中免疫治疗药物帕博利珠单抗，对 dMMR/MSI-H 的结直肠癌客观缓解率 40%，dMMR/MSI-H 的非结直肠癌客观缓解率 71%，均高于错配修复基因正常肠癌的客观缓解率0%^[1]。2017 年，美国 FDA 就已批准帕博利珠单抗治疗 MSI-H/ dMMR的实体瘤患者；在 NCCN 指南 2021.2 版中，对结肠或直肠癌患者进行 MMR 或 MSI 检测，除可判断林奇综合征外，也被指明是晚期转移性结直肠癌的免疫疗法预测标志物。

传统 MSI 检测主要以免疫组织化学和多重荧光 PCR 毛细血管电泳法为主，近年来基于二代测序的 MSI 检测应用优势愈加明显。

▪ 免疫组织化学（IHC）法

检测 MLH1、MSH2、MSH6 和 PMS2 四个错配修复蛋白的表达，判断 dMMR/ MSI-H，或配修复功能完整（pMMR）/ MSI-L/ MSS。IHC 法检测的优势是可以直接鉴定出缺陷基因，但判读对病例有一定主观性，有错判的风险。

▪ 多重荧光 PCR 毛细血管电泳法

目前公认的“金标准”，通过检测若干个微卫星位点长度分布判断微卫星的状态。以美国国家肿瘤研究所于 1997 年提出个标准微卫星位点：BAT25、BAT26、D5S346、D2S123 和 D17S250 分析为例，当存在 ≥2 个微卫星位点发生改变时为 MSI-H；仅有 1 个时为 MSI-L；若均未发生改变则为 MSS。

▪ 二代测序法

通过对靶区域包含的大量微卫星位点的测序结果分析，利用 mSINGS^[2]、msisensor^[3]等软件计算微卫星状态。相比于多重荧光 PCR 毛细血管电泳法，靶向捕获的数据可在进行基因分型、驱动突变、结构变异检测的同时分析 MSI，可降低样本用量，提高分子诊断效率。此外，传统 PCR 检测必须以正常组织为对照，判断肿瘤组织的微卫星稳定性状态，而多数 NGS-MSI 算法中采用了正常人长度分布模型，或构建正常人的微卫星分布基线，无需额外准备正常组织作为对照^[4]。 

然而，靶向捕获测序方案间覆盖区域各异，测序方式也有不同。我们在本文中将分享具体示例，以提示影响 MSI 检出稳定性的 3 个重要因素： 

• Panel 大小

• 配对样本和单样本

• 测序方式：不同读长、平台、深度

2 例配对样品，均有正常组织（normal/N）和肿瘤组织（tumor/T），其中的肿瘤组织 sampleA-T 为 MSI-H，sampleB-T 为 MSS。使用纳昂达 NadPrep^®️ DNA Library Preparation Module 构建 MGI 和 Illumina 双平台预文库，分别选取不同大小 3 款 Panel：全外显子 Panel（L-panel）、泛癌 Panel（M-panel）和靶向数十个基因的特异性 Panel（S-panel）捕获后测序。

本文使用 msisensor-pro^[5] 分析不同测序数据微卫星稳定性状态，参数均为默认参数。

表 1.Panel信息

表 2.捕获测序数据

注：M-Panel Illumina PE100的数据是从Illumina PE150中截取而来。

sampleA 和 sampleB 样品比对率、MQ20 比例、中靶率的具体信息如图1所示，数据质量较优，符合分析标准。另外，sampleA 和 sampleB 经 PCR 毛细血管电泳法检测 9 个微卫星结果如图2 所示，sampleA 为 MSI-H，sampleB 为 MSS。

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图 1. 配对样品sampleA和sampleB的靶向捕获整体结果。

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图 2.配对样品sampleA和sampleB分别为MSI-H和MSS。

msisensor-pro 通过计算样本中每一个满足分析条件的微卫星位点的稳定性 MSI/MSS，如可用的微卫星位点数为 x，评估为 MSI 的微卫星位点数为 y，则该样品微卫星不稳定占比 MSI% = (y/x)*100 %。MSI% 通常需要与阈值进行比较后，判断样品的微卫星稳定性状态。而阈值基于一定样本量和不同人群等数据支撑建立，故本文中的阈值划分仅为参考，不代表实际应用表现。

//  不同条件下MSI结果比较

▪ Panel大小

由图 3 可以看出，在配对样本分析时，尽管三种不同大小的 Panel 中，sampleA（MSI-H）和 sampleB（MSS）样品的 MSI% 值（27%~37%）存在一定的波动，但结果值相近，且均维持在各自范围内。这意味着，如果经过大量 MSI/MSS 样本测试，对三种不同大小的 Panel 确立阈值线是可行的。

▪ 配对样本和单样本

对比 Paired 和 Tumor only（图3）两种分析方法时，Tumor only 分析下 MSS样品的 MSI% 值均有不同程度升高。尤其是 MSS 样品 S-Panel 分析的 MSI% 值，已经与 MSI-H 样品的 L-Panel 分析 MSI% 值接近。但是具体到每个 Panel，MSI-H 和 MSS 样品的 MSI% 值仍有显著区别。这意味着当进行 Tumor only 分析时，仅限于在单 Panel 中区分 MSI 和 MSS 样品，不宜将不同 Panel 的 MSI 阈值直接对比。

图 3.不同Panel和分析方式的MSI检测结果。

▪ 测序方式

为评估测序平台和读长模式对 MSI% 值的影响，我们对比分析了 M-Panel 捕获后分别在MGI 和 Illumina 测序平台结果。不同测序平台以及测序读长 PE150 和 PE100 的分析结果基本一致，表明平台和读长对样本 MSI% 影响很小，且检出的 MSI 位点也基本一致（图4）。

考虑到全外显子 Panel（L-Panel）的测序深度通常较低，因此我们模拟分析了 L-Panel在不同测序深度下的 MSI% 检出情况。此时 MSI% 随着测序深度增加而提高，但是 MSI-H 和 MSS 样品的 MSI% 值差距明显，即使低至 50x 平均深度，依然可以较好的区分（图4）。

而 M-Panel 的结果也与之类似，均可显著区分 MSI-H 和 MSS。

图 4. 不同测序方式下的MSI检测结果。

//  不同条件下的MSI位点分布

上述不同样品和分析方式的 MSI 具体分布如图5 所示，当使用 L-Panel 和 M-Panel 进行 Paired 样本分析时，随着测序深度增加，MSI-H 样品检出的 MSI 位点基本呈现包含关系，即更高深度数据中的 MSI 位点包含较低深度数据中的 MSI 位点；L-Panel 的 Tumor only 检测出的 MSI 位点与 Paired 分析检出的 MSI 位点相差较大，但仍然存在共同的 MSI 位点。当使用 M-Panel 进行 Paired 样本分析时，Illumina PE150、PE100和 MGI 平台检测出的 MSI 位点几乎一致，再次表明测序平台间的差异不大。

从 MSS 的 sampleB 可以看出，L-Panel 和 M-Panel 的 Tumor only 数据因为无对照参考将部分微卫星位点判断成不稳定，除此之外，其他条件下几乎无 MSI 位点。

图 5. sampleA和sampleB不同测序数据使用msisensor-pro检测出MSI微卫星分布。

横坐标为两样本不同条件的测序数据，纵坐标为任一数据中被判断为MSI位点（所有数据均检测为MSS位点未展示）。

//  经典微卫星位点在NGS中的检出

三款 panel 中均加入了经典微卫星位点，NGS 结果统计微卫星长度分布后可与金标多重荧光 PCR 毛细管电泳结果直接对比，更有利于 NGS 分析流程的优化。如图6 中所示，以 L-panel 为例，MSI-H 样本 sampleA 的 NGS 与金标毛细管电泳结果一致地显示  BAT-25，BAT-26，MONO27，NR21，NR24，NR27 在肿瘤样本中存在明显偏移；而微卫星稳定的 sampleB 则一致地显示这 6 个微卫星位点峰形重叠。

sampleA

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sampleB

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图 6.sampleA和sampleB的肿瘤和正常样本在六个微卫星位点微卫星长度分布图。

L-Panel靶向捕获结果，横坐标为微卫星长度，纵坐标肿瘤和正常在该微卫星长度下均一化后reads数比例。

本文对 MSI-H 和 MSS 两个样品的不同条件下的测序数据进行分析，并与毛细血管电泳法进行比较，以提示 NGS 方法分析时各因素对 MSI 的影响。总的来说，设计合理的靶向捕获方案，结合一定的测序深度下的配对样本分析，可稳定的检出 MSI。靶向捕获测序还有以下优势：可进行多基因多靶点同时检测，如突变、肿瘤突变负荷、拷贝数变异等；无正常组织对照时，单样本分析也可获得较优的结果；相比于传统的 5-7 个微卫星位点，靶向捕获测序可覆盖多达上千个微卫星位点，提供更多参考。

但也应注意到，靶向捕获测序仍存在一定挑战，例如识别有良好区分性的微卫星位点需要优良的算法和大量样本验证；微卫星序列的捕获、测序难度要比一般序列更高，在建库流程、测序参数调校、生信分析等方面都更加复杂精细^[4]。

参考文献：

[1] https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01876511 

[2] Salipante S J, Scroggins S M, Hampel H L, et al. Microsatellite instability detection by next generation sequencing[J]. Clinical chemistry, 2014, 60(9): 1192-1199. 

[3] Niu B, Ye K, Zhang Q, et al. MSIsensor: microsatellite instability detection using paired tumor-normal sequence data[J]. Bioinformatics, 2014, 30(7): 1015-1016. 

[4] 中国临床肿瘤学进展. 结直肠癌及其他相关实体瘤微卫星不稳定性（MSI）检测中国专家共识解读[J]. 2019, 209-212.

[5] Jia P, Yang X, Guo L, et al. MSIsensor-pro: Fast, accurate, and Matched-normal-sample-free detection of microsatellite instability[J]. Genomics, proteomics & bioinformatics, 2020, 18(1): 65-71.