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NadPrep®️ 甲基化文库构建试剂盒

NadPrep®️ 甲基化文库构建试剂盒

货号：
#1002501
#1002502
NadPrep® 甲基化文库构建试剂盒是针对 MGISEQ & Illumina 高通量测序双平台开发的双链 DNA 甲基化测序文库构建试剂盒。本试剂盒可用于构建全基因组甲基化测序文库，结合纳昂达科技的液相杂交捕获系列产品，可实现靶向甲基化测序文库富集。
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产品特色

  • 适用于 gDNA、cfDNA 和 FFPE DNA 多类型样本
  • 可根据测序平台选择不同类型接头模块进行搭配
  • 重亚硫酸盐和酶学转化可供自由选择
  • 卓越的 5mC 和 5hmC 检测灵敏度
  • 高效转化效率

建库流程

网页版建库流程


产品表现

文库产出及转化效率

fig 1

图 1. 不同类型样本及不同转化方式的建库表现。A. 不同类型样本的文库产出，B. 不同甲基化水平的模拟样本的文库产出及 C. λ DNA C 碱基转化效率。利用 NadPrep® 甲基化文库构建试剂盒搭配 NadPrep® Methyl Adapter (SI/MDI) Module (for MGI) 分别采用酶学 (EM) 和重亚硫酸盐 (BS) 方法转化后构建文库，MGISEQ-2000，PE 100 测序。A：酶学转化，B：重亚硫酸盐转化。
注：甲基化阳性对照 100% Methylated DNA (zymo, D5014-2) 和阴性对照 0% Methylated DNA (zymo,D5014-1)，经不同比例混合以模拟不同甲基化水平 (0%，10%，50% 和 100%)，投入量均为 50 ng。

文库产出及转化效率

图 2. 不同转化方式的文库产出及转化效率。A. 两种不同类型接头经不同转化方式下的文库产出；B. 两种不同类型截短型接头经 EM 转化后的文库产出；C. 不同转化方式下的转化效率。
不同甲基化水平的模拟样本利用 NadPrep® Methyl Library Preparation Module 分别搭配 NadPrep® Methyl Stubby Adapter (UDI) Module (for Illumina®) (Stubby) 和 NadPrep® Methyl UDI Adapter Module (for Illumina®) (Full) 经酶学 (EM) 和重亚硫酸盐 (BS) 不同方法转化后构建文库。
注：甲基化阳性对照 100% Methylated DNA (zymo, D5014-2) 和阴性对照 0% Methylated DNA (zymo,D5014-1)，经不同比例混合以模拟不同甲基化水平 (0%，10%，50% 和 100%)，投入量均为 50 ng。B & C 搭配接头均为 Stubby。

捕获表现

fig 2

图 3. 不同转化方式的捕获表现。A. 捕获数据比对率和中靶率， B. 靶区域覆盖度，C. 覆盖均一性和一致性及 D. GC 偏好性。利用 NadPrep® 甲基化文库构建试剂盒搭配 NadPrep® Methyl Adapter (MDI) Module (for MGI) 分别采用酶学和重亚硫酸盐方法转化后构建文库，以甲基化 demo Panel (60 K) 进行杂交捕获， MGISEQ-2000，PE 100 测序，按照 reads 数计算。

捕获表现

图 4. 不同转化方式的捕获表现。A. 捕获数据比对率和中靶率， B. 靶区域覆盖度，C. 覆盖均一性和一致性及 D. GC 偏好性。利用NadPrep® Methyl Library Preparation Module 搭配 NadPrep® Methyl Stubby Adapter (UDI) Module (for Illumina®) 分别采用酶学和重亚硫酸盐方法转化后构建文库，以甲基化 demo Panel (60 K) 进行杂交捕获，Novaseq 6000，PE 150 测序，On-target 按照 reads 数计算。

甲基化水平准确率

fig 3

图 5. NadPrep® 不同甲基化水平样本经不同方式转化的甲基化靶向测序表现。A. 不同甲基化水平样本的实际检测结果及 B. 经酶学和重亚硫酸盐转化的靶区域 CpG 甲基化水平。利用 NadPrep® 甲基化文库构建试剂盒搭配 NadPrep® Methyl Adapter (MDI) Module (for MGI) 分别采用酶学和重亚硫酸盐方法转化后构建文库，以甲基化 demo Panel (60 K) 进行杂交捕获，MGISEQ-2000，PE 100 测序。

甲基化水平准确率

图 6. 不同甲基化水平样本经不同方式转化的甲基化靶向测序表现。A. 经酶学转化的靶区域 CpG 甲基化水平及 B. 经重亚硫酸盐转化的靶区域 CpG 甲基化水平。利用 NadPrep® Methyl Library Preparation Module 搭配 NadPrep® Methyl Stubby Adapter (UDI) Module (for Illumina®) 分别采用酶学和重亚硫酸盐方法转化后构建文库，以甲基化 demo Panel (60 K) 进行杂交捕获，Novaseq 6000，PE 150 测序。

本产品仅限研究使用，不用于临床诊断。

甲基化建库模块

包装编号 管盖颜色 组分名称 包装体积
1002501 (24 rxn) 		包装体积
1002502 (96 rxn)
Box1

EndRepair & A-Tailing Buffer 180 µL 690 µL

End Repair & A-Tailing Enzyme 120 µL 460 µL

Ligation Buffer 750 µL 2×1500 µL

DNA Ligase 65 µL 250 µL

2X HiFi-Methyl PCR Master Mix 720 µL 2×1600 µL

/

Nuclease Free Water 2.5 mL 8 mL

TE Solution 1 mL 4 mL
Box2

/

NadPrep SP Beads 4 mL 15 mL

甲基化单端接头模块 (for MGI)

管盖颜色 组分名称 包装体积
1003631 (24 rxn) 		包装体积
1003632 (96 rxn) 		包装体积
1003633 (96 rxn)

NadPrep M-Index (SI) Primer Mix  # 12×15 µL 24×25 µL 24×25 µL

NadPrep Methyl M-Adapter 60 µL 230 µL 230 µL

甲基化双端唯一接头模块 (for MGI)

管盖颜色 组分名称 包装体积
1003740 (24 rxn) 		包装体积
1003741 (96 rxn) 		包装体积
1003742 (96 rxn)

包装体积

1003743（96 rxn）

包装体积

1003744（96 rxn）

NadPrep M-Index (MDI) Primer Mix  # 12×15 µL 24×25 µL 24×25 µL 24×25 µL
 24×25 µL

NadPrep Methyl M-Adapter 60 µL 230 µL 230 µL 230 µL
 230 µL

甲基化截短型双端唯一标签接头模块

管盖颜色 组分名称 包装体积
1003371 (24 rxn) 		包装体积
1003381 (96 rxn) 		包装体积
1003382 (96 rxn)

NadPrep Universal UDI-Index Primer Mix  # 12×15 µL 24×25 µL 24×25 µL

NadPrep Methyl Stubby Adapter 60 µL 230 µL 230 µL

NadPrep Amplification Primer Mix II
 		20 µL
 		75 µL
 		75 µL

新鲜配制的 Bisulfite Reagent 使用过程中开盖能否超过 3 次，超过限定次数后是否会对产品性能有影响？

建议严格按照使用说明中要求进行使用和保存。内部测试 Bisulfite Reagent 在开盖超过 3 次后，文库产出略微降低， Lambda DNA 转化率无明显影响；为了达到产品最佳性能，建议开盖不超过 3 次。

甲基化双链建库模块中，接头 NadPrep Methyl M-Adapter/NadPrep Methyl Stubby Adapter 及 2×HiFi-Methyl PCR Master Mix 扩增酶能否用纳昂达其他接头及普通 HiFi 扩增酶替代？
均不能。甲基化接头是修饰过的，不能使用普通接头替换；甲基化转化后的文库富含 AT，必须使用甲基化建库试剂盒中适合于扩增 AT-rich 的 2×HiFi-Methyl PCR Master Mix。
对于 cfDNA 或一些特殊样本，无法向其中添加 Lambda DNA，怎么评估转化效率？
人源基因组只有 CpG 中的 C 会发生甲基化修饰，未转化文库的 Human DNA CHG/CHH 指标高。可使用该参数粗略评估转化效率，其准确性与 Lambda DNA CpG Conversion 相比较差。
甲基化探针捕获推荐的方法是 1ug 样本加 165pg Lambda DNA，捕获后的比例是多少？
基因组 DNA 与 Lambda DNA 拷贝数按照 1:10 比例混合，理论上测序深度 1:10。
样本中掺入混合进去的 lambda DNA 目的 ? 如何混合？
通过向 gDNA 样本添加 Lambda DNA，然后评估 Lambda DNA CpG 转化率，要求 Lambda DNA 转化效率 >99%。Lambda DNA 添加方式为：1ug gDNA+165pg Lambda DNA，混合均匀后进行 Covaris 打断。
甲基化文库构建过程中未发生甲基化修饰的 C 碱基转化率低于 99% 的可能原因有哪些？该如何解决？

可能原因

解决方案

转化后文库被未转化文库污染 

使用带滤芯 Tips；转化结束后及时更换新的乳胶手套， 更换新的工作台面以及新的移液器。

Bisulfite Reagent 容易发生氧化，结晶析出，导致亚硫酸盐溶液浓度降低，影响转化效率

在有效期以内使用转化试剂盒；控制 Bisulfite Reagent 暴露在空气中的时间。

投入量过高 

使用酶转化方案时，严格控制样本投入量，推荐投入量 在 10-200 ng 之间。

甲基化文库构建过程中造成文库产量偏低的可能原因有哪些？该如何解决？

可能原因

解决方案

原始样本定量存在误差 

实际起始投入量偏低，建议使用 Qubit 进行精确定量

磁珠纯化过程中丢弃部分磁珠 采用涡旋混匀时，确保管盖紧闭，弃上清过程切勿丢弃磁珠

低投入量样本使用重亚硫酸盐转化方案时，单链 DNA 回收效率较低。PCR 扩增循环数差3 个左右

增加扩增循环数，低投入量样本选择酶转化方案。

数据产出低的可能原因有哪些？该如何解决？
数据产出低的可能原因是同条 lane 甲基化测序量占比高于 70%，需提高非甲基化文库的占比，推荐每条 lane 中非甲基化文库测序量占比不低于 30%。

类别 产品 详情 货号
甲基化建库模块 NadPrep® Methyl Library Preparation Module, 24 rxn 24 rxn 1002501
NadPrep® Methyl Library Preparation Module, 96 rxn 96 rxn 1002502
BS 转化模块 NadPrep® DNA Methyl Bisulfite Conversion Module, 24 rxn 24 rxn 1002701
NadPrep® DNA Methyl Bisulfite Conversion Module, 96 rxn 96 rxn 1002702
甲基化单端接头模块 (for MGI) NadPrep® Methyl Adapter (SI) Module Set A1 (for MGI), 24 rxn SI 1-12 1003631
NadPrep® Methyl Adapter (SI) Module Set B1 (for MGI), 96 rxn SI 1-24 1003632
NadPrep® Methyl Adapter (SI) Module Set B2 (for MGI), 96 rxn SI 25-48 1003633
甲基化双端唯一接头模块 (for MGI) NadPrep® Methyl Adapter (MDI) Module Set A1 (for MGI), 24 rxn MDI 1-12 1003740
NadPrep® Methyl Adapter (MDI) Module Set B1 (for MGI), 96 rxn MDI 1-24 1003741
NadPrep® Methyl Adapter (MDI) Module Set B2 (for MGI), 96 rxn MDI 25-48 1003742
NadPrep® Methyl Adapter (MDI) Module Set B3 (for MGI), 96 rxn MDI 49-72 1003743
NadPrep® Methyl Adapter (MDI) Module Set B4 (for MGI), 96 rxn MDI 73-96 1003744
甲基化截短型双端唯一 接头模块 NadPrep® Methyl Stubby Adpater (UDI) Module Set A1 (with 10 nt Index), 24 rxn UDI 1-12 1003371
NadPrep® Methyl Stubby Adpater (UDI) Module Set B1 (with 10 nt Index), 96 rxn UDI 1-24 1003381
NadPrep® Methyl Stubby Adpater (UDI) Module Set B2 (with 10 nt Index), 96 rxn UDI 25-48 1003382




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