甲基化文库构建黄金搭档——单链建库技术
01背景
DNA 甲基化作为一种重要的表观遗传修饰，在癌症、遗传学、表观遗传学和干细胞研究领域应用广泛[1]。目前，亚硫酸氢盐转化 (Bisulfite conversion, BS) 是 DNA 转化的主流技术之一。通过亚硫酸氢盐处理 DNA，将 DNA 中未甲基化的胞嘧啶 (C) 转化为尿嘧啶 (U)，之后经 PCR 扩增后进一步变成胸腺嘧啶 (T)，而原本甲基化的 C 保持不变，通过测序后对 DNA 序列的分析区分甲基化状态的不同。然而 BS 转化过程中剧烈的温度和 pH 变化会导致 DNA 降解和断裂，因此更适用于起始量较高的样本。
NGS 可同时进行数百个至全基因组的 DNA 甲基化检测，并结合不同的基因 Panel 进行选择。DNA 甲基化检测的文库构建策略分为“先建库后转化”和“先转化后建库”两种。DNA 单链建库技术可对 BS 转化处理后的单链及损伤 DNA 最大程度的利用和转化，从而提供完整性更高、偏好性更低的甲基化文库，尤其是低起始投入量样本。
在上篇文章中，我们已经了解了单链建库对双低样本的稳定建库情况，本期就跟着小编一起看看单链建库技术为我们提供的高精度甲基化建库解决方案吧~
02ssDNA 通用型文库制备解决方案 (for Illumina®)
2.1方案简介
ssDNA 通用型文库制备方案 (for Illumina®) 基于高效的单链连接原理，专为 Illumina® 高通量测序平台而开发。该方案特别适用于低质量样本和微量样本的文库构建，起始量可从 10 pg 到 250 ng。经过优化设计，该方案适用于 cfDNA、gDNA、FFPE DNA 样本的全基因组甲基化测序，同时兼容液相杂交靶向捕获测序。
2.2单链甲基化文库制备流程
图 1. 单链甲基化文库制备方案。
2.3方案特点
图 2. ssDNA 通用型文库制备方案 (for Illumina®) 方案特点。
03方案表现
3.1稳定高效的捕获表现及转化效率
我们将人类 DNA 甲基化标准品按不同比例混合，以模拟不同甲基化水平的样本。将其分别应用于 ssDNA 通用型文库制备方案 (for Illumina®) 和双链建库方案中，结果显示，单链建库方案在各甲基化水平下均表现出比双链建库更高的比对率和中靶率 (图 3. A)，且 C 碱基转化率与双链建库基本持平 (图 3. B)，高达 99% 以上。
图 3. 不同甲基化水平 gDNA 样本经不同文库制备方案的捕获表现及转化效率。 A. 比对率 & 中靶率；B. C 碱基转化效率。以 NadPrep® Hybrid Capture Reagents 和 Demo Panel (60 Kb) 进行杂交捕获。
注：样本为人甲基化阴性对照 0 % Methylated DNA (zymo,
D5014-1) 和阳性对照 100 % Methylated DNA (zymo, D5014-2) 经不同比例混合以模拟不同甲基化水平 (0%，10%，50% 和 100%)。投入量为 25 ng，亚硫酸氢盐转化使用 NadPrep® DNA Methyl Bisulfite Conversion Module。
3.2更高的数据利用率
同时，我们分别采用 ssDNA 通用型文库制备方案 (for Illumina®) 和双链建库方案对 gDNA 样本进行了甲基化建库，结果如图 4. 所示。与双链建库相比，单链建库在不同起始投入量下获得了更高的文库产出，其表现出的优势在低投入量时更为显著 (图 4. A)。此外，单链建库较双链建库能够达到更高的平均测序深度 (图 4. B)，是后者的 1.4-2.5 倍。
图 4. 不同文库制备方案对 gDNA 样本的甲基化建库表现比较。A. 文库产量；B. 平均测序深度 (去重后)。
注：样本为人类基因组 DNA 标准品 (Promega，G1521)。
3.3低GC 偏好性
分别使用 ssDNA 通用型文库制备方案 (for Illumina®) 与双链建库方案进行甲基化建库，杂交捕获后 GC 偏好性如图 5. 所示，可以清晰地看到单链建库的 GC 偏好性更低，并且在不同投入量下的偏好情况较为一致。
图 5. 不同文库制备方案对 gDNA 样本的甲基化建库捕获后 GC 偏好性比较。
3.4更准确的甲基化水平评估
ssDNA 通用型文库制备方案 (for Illumina®) 在连接反应时，在核酸片段 3’ 末端引入一段复杂度较低的同聚碱基。为测试外源碱基对甲基化水平评估的影响，我们将测序下机数据进行了预处理，对比“切除”与不“切除”数据的 C 碱基转化率。结果显示 (图 6.)，不论是否“切除”，ssDNA 通用型文库制备方案 (for Illumina®)
(NadPrep_ssDNA) 所得到的 C 碱基转化率与双链建库 (NadPrep_dsDNA) 相比均无较大差异；相比之下，Vendor I* 若不对数据进行“切除”处理，此时的 C 碱基转化率显著低于 99%，则会对结果产生较大影响。因此，ssDNA 通用型文库制备方案 (for Illumina®) 表现出更加准确的甲基化水平评估能力，且其外源碱基对甲基化水平评估无显著影响。
图 6. ssDNA 通用型文库制备方案与双链建库及同方法学竞品相比对甲基化水平评估的影响程度。
3.5竞品比较
我们将 ssDNA 通用型文库制备方案 (for Illumina®) (NadPrep®) 与 Vendor I*进行了性能比较，结果展现出了 NadPrep® 绝对的建库优势 (图 7.)。在相同的条件下，NadPrep® 能够帮助我们实现更高的靶区域覆盖度 (图 7. A)，进而对样本信息有更加全面的了解。同时，对于相同的样本投入量，NadPrep® 所达到的去重后测序深度是 Vendor I* 的 3-4 倍，从而降低了测序成本。对于不同甲基化水平的模拟样本的检出结果与 Vendor
I* 相当 (图 7. C & D)。
图 7. 不同单链建库试剂盒性能比较。A. 靶区域覆盖度；B. 平均测序深度 (去重后)；C. 不同甲基化水平的模拟样本的实际检测结果；D. 靶区域 CpG 甲基化水平。亚硫酸氢盐转化使用 Zymo EZ DNA Methylation-Lightning Kit。
04应用展望
单链建库技术在低质量、低投入量样本建库和甲基化建库方面展现了巨大潜力。其高效的转化能力使其能够处理受损、降解或微量的 DNA 样本，为癌症早期诊断和个性化诊疗提供了新的可能性。同时，单链建库在甲基化研究中也表现出优异的性能，为解析基因组的表观遗传学调控提供了有力工具。这一技术的不断发展将为基因组学研究和临床应用带来更加全面和精确的信息，从而推动生物医学领域的进步。
参考文献
[1] Sun Z, Behati S, Wang P, et al.
Performance comparisons of methylation and structural variants from low-input
whole-genome methylation sequencing[J]. Epigenomics, 2023, 15(1): 11-19.
