Universal Module - 纳昂达 | 靶向精准用心服务诊断

为保证数据质量，最好在说明书推荐的范围内建库。如果有特殊的实验需求，也可以适当调整。纳昂达测试的其他input量建库效果如下：

实验条件：Human Genomic DNA Male（Promega，catalog # G1471），分别使用不同的 input 量进行片段化，酶切时间 25 min。搭配 NadPrep® Universal Stubby Adapter (UDI) Module，单筛选建库。文库产出和 size 符合上机需求。

片段筛选模式有几种方案，如何选择？

片段筛选推荐

适用情况

优点

缺点

步骤一

可选步骤：

片段化后双筛

DNA样本量丰富；

片段化后片段分布较宽

片段更集中，文库连接效率、测序数据均一性较好

DNA片段损失量较大

步骤四

可选步骤：

连接后双筛

DNA样本量较丰富；

连接后片段分布较宽

片段较集中，测序数据均一性较好

需要根据样本片段长度严格挑选合适的双筛条件

● 片段化后双筛损失量

此步骤筛选可以使片段化样本更加集中，后续接头连接效率高，但是样本损失量比较大（~60-70%），适合样本量丰富的样本建库。建议DNA input量 ≥ 200 ng。

实验条件：Human Genomic DNA Male（Promega，catalog # G1471），500 ng分别使用不同的酶切时间进行片段化，程序：25℃-X min，65℃-30min；片段化程序结束，使用说明书附录二1.1，片段化后双筛条件。筛选完成后使用Nuclease Free water洗脱，进行后续连接接头步骤。

● 连接后双筛损失量

此步骤双筛选相比单筛选文库损失15-25%，使文库峰形更加集中的同时相比片段化后双筛选减少了文库损失，但低质量DNA样本或Input DNA ≤ 50 ng时不建议使用。

实验条件：Human Genomic DNA Male（Promega，catalog # G1471），100 ng分别使用不同的酶切时间进行片段化，在完成接头连接后分别使用单筛选和双筛选模式（详见说明书附录二1.2）。

市面常用的提取试剂盒的EDTA浓度是多少？

品牌	试剂盒名称	货号	洗脱溶剂名称	洗脱溶剂组成
Promega	MagneSil Blood Genomic, Max Yield System	MD1360	Elution Buffer	(10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0)
QIAGEN	QIAamp DNA FFPE	56404	Buffer ATE	(10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0)
	GeneRead DNA FFPE Kit	180134	Buffer ATE	(10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0)
	DNeasy Blood & Tissue Kit	69506	Buffer EB	10 mM Tris-Cl, pH 8.5
Thermo Fisher Scientific	PureLink Genomic DNA Mini Kit	K182001	Elution Buffer	10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 0.1 mM EDTA
天根生化科技	磁珠法通用型基因组DNA提取试剂盒	DP705	Buffer TB	10 mM Tris-Cl, pH 8.0
	血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒	DP304	Buffer TE	(10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0)
	石蜡包埋组织DNA提取试剂盒（离心柱型）	DP331	Buffer TE	(10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0)
康为世纪	Blood Genomic DNA Midi Kit (1-5ml)	CW0541	Buffer GE	10 mM Tris，0.1 mM EDTA（pH 8.5）
	FlexGen Blood DNA Kit (0.1-20ml)	CW0544	Buffer GE	10 mM Tris，0.1 mM EDTA（pH 8.5）
	FFPE DNA Kit	CW0547	Buffer GE	10 mM Tris，0.1 mM EDTA（pH 8.5）

影响酶切建库size不稳定的主要因素有哪些？

主要因素①样本质量差异：样本是否降解。降解的样本可根据说明书参考时间，以 3-5 min 梯度缩短酶切时间。

②样本溶剂：含有 EDTA 或过高 pH（pH大于8.0，如 pH 8.5）的溶剂。样本中有 EDTA 存在时，如未纯化，也未加入 Enhancer Buffer，或者溶剂 pH 过高会造成片段化不足，文库 size 过大不符合上机需求。

如下图：

血液 gDNA 样本含不同量的 EDTA 终浓度建库，input 50 ng，酶切时间 25 min，扩增 6 个循环。使用 Qsep 100进行片段质检：EDTA 浓度越高，酶切片段越大。

DNA样本在进行文库构建之前需如何进行质检？

NadPrep^® 快速DNA酶切文库构建试剂盒v2 兼容多种类型样本的文库构建，包括全血 gDNA、FFPE 等。对于复杂样本的处理（如 FFPE 样本），推荐从源质控，DNA 样本中若有蛋白质、酚类等杂质残留，可能会影响酶切打断效果。另酶切片段化试剂多对 EDTA 浓度敏感，应避免使用含 EDTA 的溶剂溶解，如有必要可进行 1.8-2.0× 磁珠纯化去除。

● 样本溶剂：推荐使用无核酸酶水或 10 mM Tris-HCl (pH 7.5-8.0) 溶解 DNA 样品（酶切片段化试剂对 EDTA 浓度敏感，此步骤需确认溶剂中 EDTA 的浓度。过高的溶剂 pH 可能会影响酶活，造成片段化程度不足，如有必要可进行 1.8X 磁珠纯化）。

● 样本定量：常规 gDNA 样本推荐使用基于分光光度计原理的 NanoDrop 和基于双链 DNA 荧光染料的 Qubit^®、PicoGreen^® 进行定量。

● 样本纯度：OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.8-2.0；OD₂₆₀/OD₂₃₀=2.0-2.5。

● 样本片段分布：可推荐使用 1% 的琼脂糖凝胶电泳进行样本 size 检测或生物分析仪（如Agilent 2100）DIN 值进行样本完整性评估。样本的分级可参照下图简单分为四级（此为基础的四级分类法，也可根据实际情况进行更为细致的划分）。不同等级的 FFPE 样本酶切时间可参考说明书上下调整时间。

若样本体积不足40μL，可以使用NadPrep® 快速DNA酶切文库构建试剂盒的TE Solution补足体系吗？

不可以，应使用Nuclease-Free water补足样本体系。TE Solution的成分为10 mM Tris，0.1 mM EDTA (pH 8.0)。可用于文库保存。

NadPrep® 快速DNA酶切文库构建试剂盒的酶切具有哪些特点？

FERA Enzyme片段化程度与时间和温度有关。DNA片段化大小与酶切时间具有依赖关系，可以根据酶切时间灵活调控DNA片段大小。

如何确认 RNACap 过程的 DNA 污染？

推荐靶向捕获 Panel 中包含 Non-exonic 区域探针或与 Non-exonic control panel 混合使用，以便确认或评估 DNA 污染。

是否有标准品推荐，以检测实验流程及数据质控？

纳昂达推荐使用标准品 ERCC（External RNA Control Consortium） RNA Spike In Mix（货号，4456740），此序列包含 92 条长约 250-2000 nt 的寡聚核苷酸。可参考说明书推荐，掺入待测 RNA 样本中，再按常规流程进行文库构建，后续搭配纳昂达 Ext-RNA Control Panel v1.0, 96 rxn（货号，1001651），进行靶向测序的 ERCC 标准曲线分析。

Total RNA-seq、rRNA-depleted RNA-seq 和 RNA-Cap 选择？

纳昂达内部测试了直接测序（Total RNA-seq）、去除 rRNA 后测序（rRNA-depleted RNA-seq）和捕获后测序（RNA-Cap）。结果显示，Total RNA-seq 与 rRNA-depleted RNA-seq 的基因表达基本一致，且无明显富集，RNA-Cap 则可明显富集靶区域。

纳昂达推荐提取后的总 RNA 使用总 RNA 逆转录模块搭配 DNA 通用建库模块及靶向捕获模块，进行 RNA-Cap 的靶向捕获，可获得更高的测序量及目的靶区域信息。

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