NadPrep® 快速DNA酶切文库构建试剂盒v2 兼容多种类型样本的文库构建，包括全血 gDNA、FFPE 等。对于复杂样本的处理（如 FFPE 样本），推荐从源质控，DNA 样本中若有蛋白质、酚类等杂质残留，可能会影响酶切打断效果。另酶切片段化试剂多对 EDTA 浓度敏感，应避免使用含 EDTA 的溶剂溶解，如有必要可进行 1.8-2.0× 磁珠纯化去除。
● 样本溶剂：推荐使用无核酸酶水或 10 mM Tris-HCl (pH 7.5-8.0) 溶解 DNA 样品（酶切片段化试剂对 EDTA 浓度敏感，此步骤需确认溶剂中 EDTA 的浓度。过高的溶剂 pH 可能会影响酶活，造成片段化程度不足，如有必要可进行 1.8X 磁珠纯化）。
● 样本定量：常规 gDNA 样本推荐使用基于分光光度计原理的 NanoDrop 和基于双链 DNA 荧光染料的 Qubit®、PicoGreen® 进行定量。
● 样本纯度：OD260/OD280=1.8-2.0；OD260/OD230=2.0-2.5。
● 样本片段分布：可推荐使用 1% 的琼脂糖凝胶电泳进行样本 size 检测或生物分析仪（如Agilent 2100）DIN 值进行样本完整性评估。样本的分级可参照下图简单分为四级（此为基础的四级分类法，也可根据实际情况进行更为细致的划分）。不同等级的 FFPE 样本酶切时间可参考说明书上下调整时间。
不可以，应使用Nuclease-Free water补足样本体系。TE Solution的成分为10 mM Tris，0.1 mM EDTA (pH 8.0)。可用于文库保存。
推荐靶向捕获 Panel 中包含 Non-exonic 区域探针或与 Non-exonic control panel 混合使用，以便确认或评估 DNA 污染。
纳昂达推荐使用标准品 ERCC（External RNA Control Consortium） RNA Spike In Mix（货号，4456740），此序列包含 92 条长约 250-2000 nt 的寡聚核苷酸。可参考说明书推荐，掺入待测 RNA 样本中，再按常规流程进行文库构建，后续搭配纳昂达 Ext-RNA Control Panel v1.0, 96 rxn（货号，1001651），进行靶向测序的 ERCC 标准曲线分析。
纳昂达内部测试了直接测序（Total RNA-seq）、去除 rRNA 后测序（rRNA-depleted RNA-seq）和捕获后测序（RNA-Cap）。结果显示，Total RNA-seq 与 rRNA-depleted RNA-seq 的基因表达基本一致，且无明显富集，RNA-Cap 则可明显富集靶区域。
纳昂达推荐提取后的总 RNA 使用总 RNA 逆转录模块搭配 DNA 通用建库模块及靶向捕获模块，进行 RNA-Cap 的靶向捕获，可获得更高的测序量及目的靶区域信息。
如后续直接测序，建议去除。总RNA逆转录模块可兼容市场上其他rRNA商用试剂盒定向去除，如NEBNext® rRNA Depletion Kit v2（NEB），AnyDeplete Module（NuGen）等。如后续用于靶向捕获则可无需去除。
总 RNA 逆转录模块兼容多种类型样本，包括细胞、组织、FFPE 样本等。对于复杂样本的处理（如 FFPE 组织样本），推荐从源质控。样本应选取合适的提取试剂盒，并进行相应的定量及片段质检，建议如下：
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类别 |
要求 |
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提取试剂盒推荐 |
细胞系 RNA |
AllPrep DNA/RNA Mini Kit（Qiagen；货号，80204） |
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FFPE RNA |
AllPrep DNA/RNA FFPE Kit（Qiagen；货号，80234） |
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定量 |
基于分光光度计原理的NanoDrop和基于荧光染料的 Qubit® RNA HS Assay 定量 |
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纯度 |
OD260/OD280=1.7-2.0。OD260/OD280>2.0 表明有异硫氰酸污染，<1.7 表明有蛋白质等污染 |
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完整性 |
定量法 |
RNA IQ（By Qubit™ RNA IQ Assay Kit）＞4 RIN（By Agilent 2100）＞3 DV200（By Agilent 2100；＞200 nt RNA所占比例）＞50% |
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条带检测法 |
2%的琼脂糖凝胶电泳或生物分析仪，如 Agilent 2100、Bioptic（Qsep）进行样本完整性评估。 |
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TE Solution的成分为10 mM Tris，0.1 mM EDTA（pH 8.0）。