| 可能原因 | 解决方案 |
| 核酸投入量偏低 |
若共建库样本为共提取 total 核酸样本，需对样本中的 RNA和 DNA 分别进行 Qubit 定量，并根据样本类型按说明书中推荐扩增循环数进行文库扩增 |
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实验过程中须使用 RNase-free 耗材，操作环境确保无 RNase 污染，否则会影响 RNA 样本的反转效率 |
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| 共建库核酸样本中若含有过多的螯合剂、胍盐、苯酚、蛋白质、乙醇等杂质，会影响 RNA 反转录酶活性，建议参考步骤七：扩增文库纯化使用 2X NadPrep® SP Beads 纯化核酸样本，替换洗脱试剂为 Nuclease Free Water |
| 可能原因 | 解决方案 |
| 病原载量低 |
适当增加 PCR 循环数 |
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转管时未将反应液全部转出 |
转管时务必将每一步的溶液全部转移至新的反应管 |
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杂交以及磁珠纯化过程丢弃部分磁珠 |
洗脱过程操作避免过于剧烈，弃上清过程切勿丢失磁珠 |
| 可能原因 | 解决方案 |
| 样本存在反应抑制剂 (如 EDTA、高 pH 值等) | 对样本进行纯化后再进行试验 |
| 试剂保存不当 | 试剂总量较大时，建议分装使用，避免反复冻融 |
| 可能原因 | 解决方案 |
| 起始投入量过高 | 建议使用 Qubit™ 3.0 进行定量 |
| 扩增循环数偏高 | 根据操作指南推荐方案摸索最佳扩增循环数 |
| 洗脱过程未按照操作指南进行，导致脱靶严重 | 洗脱过程严格按照操作指南要求进行操作 |
| 可能原因 | 解决方案 |
| 起始投入量不准确 | 实际起始投入量偏低，建议使用 qPCR 进行精确定量 |
| 转管时未将反应液全部转出 | 转管时务必将每一步的溶液全部转移至新的反应管 |
| 杂交以及磁珠纯化过程丢弃部分磁珠 | 洗脱过程操作避免过于剧烈，弃上清过程切勿丢失磁珠 |
| 可能原因 | 解决方案 |
| 洗脱过程产生大量气泡 | 移液器使用时需轻柔吹吸混匀，避免进入空气；若产生气泡，可先用移液器将液面上方气泡吸干净后再弃上清 |
| 未更换 PCR 管盖 | 严格按照说明书要求更换 PCR 管以及管盖 |
| 试剂未完全混匀 | 试剂使用前严格按照操作指南要求进行混匀，并置于相应的温度预热 |
| 可能原因 | 解决方案 |
| 起始投入量过高 | 建议使用 Qubit™ 3.0 进行定量 |
| 扩增循环数偏高 | 根据操作指南推荐方案摸索最佳扩增循环数 |
| 洗脱过程未按照操作指南进行，导致脱靶严重 | 洗脱过程严格按照操作指南要求进行操作 |
| 可能原因 | 解决方案 |
| 起始投入量不准确 | 实际起始投入量偏低，建议使用 qPCR 进行精确定量 |
| 转管时未将反应液全部转出 | 转管时务必将每一步的溶液全部转移至新的反应管 |
| 杂交以及磁珠纯化过程丢弃部分磁珠 | 洗脱过程操作避免过于剧烈，弃上清过程切勿丢失磁珠 |
| 可能原因 | 解决方案 |
| 洗脱过程产生大量气泡 | 移液器使用时需轻柔吹吸混匀，避免进入空气；若产生气泡，可先用移液器将液面上方气泡吸干净后再弃上清 |
| 未更换 PCR 管盖 | 严格按照说明书要求更换 PCR 管以及管盖 |
| 试剂未完全混匀 | 试剂使用前严格按照操作指南要求进行混匀，并置于相应的温度预热 |
| 可能原因 | 解决方案 |
| NEM Fragment Enzyme Mix 使用以及保存不当 | NEM Fragment Enzyme Mix 使用前分装保存，冰盒拿取，避免存放在温度波动较大之处。若该组分存放时间较长导致切割效率降低，可将片段化时间延长 5 min。 |