基因融合怎么做？ 新品| OncoFu Elite (for RNA) Panel 了解下！ （下篇）

OncoFu Elite (for RNA) Panel v1.0（以下简称为OncoFu E）是一款适用于 RNA 水平融合分析的基因检测 Panel，靶向区域为 105 个实体瘤研究中最为常见或具有临床意义的融合相关基因，例如非小细胞肺癌相关的 ALK、RET、ROS1 和膀胱癌相关的 FGFR3 等。

随着越来越多的基因融合被报道和关注，尽管靶向文献和公开数据库中所有已知癌症相关基因设计一款大 Panel 理论上是可行的，但是 RNA 靶向捕获测序的整体灵敏度与捕获基因表达之和成反比^[1]，扩大基因列表将对检测灵敏度提出严峻挑战。OncoFu E 则兼顾分析广度和灵敏度，精选 105 个实体瘤相关基因为靶区域。

基因融合更多地发生于基因编码区，但非翻译区 (UTR) 也有存在不少具有明确临床意义的融合。以 TMPRSS2-ERG 为例，TMPRSS2 基因的 5’ UTR 与 ERG 基因发生融合，从而导致 oncogene ERG 的过表达。这一融合 mRNA 在前列腺癌中为常见高频表达，可作为前列腺癌早期诊断的一种生物标志物^[2]。因此，OncoFu E 结合已有数据库信息，也将部分基因的 UTR 区作为靶区域，以增强融合分析的灵敏度。

具体基因列表如下：

*覆盖全部5'-UTR，†覆盖全部3'-UTR。

为富集靶基因的多个转录本，一种常规设计思路是将该基因所有外显子区合并，基于基因组序列进行设计，但是难免会遇到较短的外显子。此时因探针可结合区域过短，只能依靠邻近外显子探针间接覆盖（图1）。作为专门针对 RNA 捕获的 OncoFu E，探针设计则是基于靶基因在 RefSeq 109 中正式收录的所有转录本序列进行叠瓦式覆盖，极大地保障了杂交捕获的可靠性。同一个基因多个转录本之间存在差异，也存在大量可被同一组探针覆盖的区域，而我们经优化的算法，可保证每个转录本都达到 2X 叠瓦覆盖的同时，去除反复覆盖一致区段的冗余探针，使得每个转录本的探针覆盖更为合理，探针利用率也更高。

▶▶图 1 |不同探针设计方案下对 ERBB2 NM_004448 转录本的覆盖情况。

5 号外显子在基因组 1X 和基因组 2X 探针设计中均需要邻近外显子探针补充；8 号外显子在基因组 1X 设计中邻近探针也缺乏具有充足结合长度的探针；而 OncoFu E 基于 cDNA 序列的设计对于所有区域都有全长探针结合。

对 reference RNA 文库进行标准流程 OncoFu E 捕获，mapped reads 中 90% 为中靶，原始测序数据中 >80% 为来自靶基因的有效 reads，而 rRNA 相关 reads 占比仅 ~6%（图2A）。与未经富集的直接测序 (RNAseq) 相比，105 个靶基因均被显著富集，且相对表达丰度重现性良好（图2B）。

▶▶图 2 | OncoFu E 的捕获表现。

A. 典型的捕获测序数据组成； B. 捕获测序与 RNAseq 数据靶基因相对丰度的比较。

Human Brain Total RNA 标准品 (HBR，Clontech，货号：636530) 利用 NadPrep^® Total RNA-To-DNA Module 搭配 NadPrep^® DNA 通用型文库构建试剂盒系列建库，分别进行：直接测序 (RNAseq) 或 OncoFu E 捕获测序 (OncoFu E)。

我们首先利用 FFPE 融合 RNA 参考品 (Seraseq^® FFPE Tumor Fusion RNA v4 Reference Material) 比较 OncoFu E 捕获测序相对于未经富集的直接测序 (RNAseq) 和去除 rRNA 测序 (rRNA-depleted RNAseq) 对基因融合分析能力的提升。与未经捕获富集的文库相比，单次靶向捕获时每 Gb 数据获得的融合支持 reads 数至少有 2 个数量级的提升，且远远大于增加去除 rRNA 步骤对 RNAseq 的提升（图3A）。

对 100 ng 不同稀释程度的融合参考品的进一步研究表明，每 Gb 数据量下，即使在稀释 128 倍之后，16 个融合位点依然可被 OncoFu E 靶向富集后有效检测，在 512 倍稀释后出现一个融合位点无支持 reads （图3B）。这表明 OncoFu E 对融合 RNA 的富集可有效的转化为灵敏度的提升。 

▶▶ 图 3 | OncoFu E 应用于 FFPE 融合 RNA 参考品基因融合分析示例。

A. OncoFu E 靶向富集与 RNAseq 的比较； B.参考品倍数稀释后 OncoFu E 的靶向富集表现。

100 ng Seraseq^® FFPE Tumor Fusion RNA v4 Reference Material 利用 NadPrep^® Total RNA-To-DNA Module 搭配 NadPrep^® DNA 通用型文库构建试剂盒系列建库，分别进行：直接测序 (RNAseq)，去除 rRNA 测序 (rRNA-depleted RNAseq，NEBNext rRNA Depletion Kit v2) 和 RNA 捕获测序 (OncoFu E)，对每 Gb 数据量进行融合分析 (FusionCatcher v1.10)。

参考文献

[1] Heyer EE, Deveson IW, Wooi D, et al. Diagnosis of fusion genes using targeted RNA sequencing. Nat Commun. 2019;10(1):1388.

[2] Wang J, Cai Y, Ren C, Ittmann M. Expression of variant TMPRSS2/ERG fusion messenger RNAs is associated with aggressive prostate cancer. Cancer Res. 2006;66(17):8347-8351.